農(nóng)桿菌介導(dǎo)柚木腋芽原基遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、柚木(Tectona grandis L．f)是世界著名的熱帶珍貴用材樹種，廣泛用于造船、橋梁、高級(jí)家具和雕刻等。柚木是我國(guó)熱帶、南亞熱帶地區(qū)的主要造林和經(jīng)濟(jì)樹種，九省六十多個(gè)縣(市)均有柚木引種栽培。我國(guó)沒有柚木的天然分布，種質(zhì)資源十分缺乏，其栽培受到土壤酸性、低溫凍害、銹病、臺(tái)風(fēng)、野螟等許多問題的困擾。因此，開發(fā)柚木的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，研制抗寒、抗蟲、抗病、速生的轉(zhuǎn)基因新品種，對(duì)于我國(guó)柚木的推廣栽培具有重要意義。 本研究對(duì)農(nóng)桿菌

2、轉(zhuǎn)化柚木愈傷組織的參數(shù)、轉(zhuǎn)化腋芽原基的參數(shù)、腋芽原基解剖結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化植株的篩選、轉(zhuǎn)化植株的鑒定等開展了系列研究，得出的主要結(jié)論如下： 1) EHAl05轉(zhuǎn)化柚木愈傷組織的適宜參數(shù)為：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間11～13天，菌液光密度0.4～0.5，接種時(shí)間25分鐘，共培養(yǎng)時(shí)間7～9天，共培養(yǎng)pH值6.0。LBA4404的適宜參數(shù)為：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間11～15天，菌液光密度0.5～0.8，接種時(shí)間25分鐘，共培養(yǎng)時(shí)間13天，共培養(yǎng)pH值5.6～6.2。重

3、新懸浮的作用明顯，乙酰丁香酮的作用不明顯。不同無性系對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的敏感性不一樣，7813、108和7531三個(gè)無性系的愈傷組織具有較高的轉(zhuǎn)化率。但柚木愈傷組織的再生能力非常低，暫時(shí)難以通過愈傷組織的再生獲得轉(zhuǎn)基因植株。 2)柚木的腋芽原基位于緊貼葉柄著生點(diǎn)上側(cè)的莖段表面，在垂直方向上正好緊貼節(jié)棱邊的上側(cè)。緊貼節(jié)的上側(cè)切斷莖段時(shí)，切口對(duì)準(zhǔn)腋芽原基的幾率最高，最容易誘導(dǎo)農(nóng)桿菌對(duì)腋芽原基的轉(zhuǎn)化。腋芽原基受到創(chuàng)傷后所具有的恢復(fù)和發(fā)育能力

4、，使得被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的腋芽原基細(xì)胞在篩選過程中能逐漸替代整個(gè)腋芽原基，并發(fā)育成完整的轉(zhuǎn)化腋芽。 3) LBA4404轉(zhuǎn)化柚木腋芽原基的適宜參數(shù)為：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間3～5天，菌液光密度0.5，共培養(yǎng)時(shí)間5～9天，共培養(yǎng)pH值5.6～6.0，共培養(yǎng)溫度27℃，侵染率高的無性系為108，外植體為增殖培養(yǎng)26～36天的上部和中部枝段。EHA105轉(zhuǎn)化柚木腋芽原基的適宜參數(shù)為：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間3～5天，菌液光密度0.5，共培養(yǎng)時(shí)間3～6天，共培養(yǎng)pH值

5、5.2～5.4，共培養(yǎng)溫度27℃，侵染率高的無性系為108，外植體為增殖培養(yǎng)36天的中部和上部莖段。 4) 柚木愈傷組織對(duì)卡那霉素比較敏感，低濃度時(shí)即可有效抑止其萌發(fā)。適宜于抑制108無性系愈傷組織萌發(fā)的卡那霉素濃度為20～25mg/L，7531無性系為15～20mg/L。具有一定大小的愈傷組織團(tuán)的卡那霉素抗性明顯加強(qiáng)，能有效抑止108無性系愈傷組織團(tuán)生長(zhǎng)的卡那霉素濃度為75mg/L。 5) 柚木腋芽原基對(duì)卡那霉素的抗

6、性存在基因型差異，適宜于抑制7663無性系腋芽萌發(fā)的卡那霉素濃度為50mg/L，8003無性系為50～100mg/L，7557和108無性系為100～150mg/L。柚木腋芽原基轉(zhuǎn)化的篩選過程需要變動(dòng)選擇壓力，108無性系的適宜篩選程序?yàn)椋?50mg/L卡那霉素、250mg/L頭孢霉素和250mg/L 羧芐青霉素篩選與脫菌18天→50mg/L卡那霉素、250mg/L頭孢霉素和250mg/L羧芐青霉素篩選與脫菌 18 天→100mg/L卡

7、那霉素、250mg/L頭孢霉素和250mg/L羧芐青霉素篩選與脫菌18天→100mg/L卡那霉素篩選與繁殖轉(zhuǎn)化植株。 6) GUS 染色結(jié)果表明，采用腋芽原基轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化柚木無性系是可行的。以外植體計(jì)算，LBA4404和：EHA105兩個(gè)菌種的轉(zhuǎn)化率均為0.185％。以通過篩選培養(yǎng)的T0代植株計(jì)，LBA4404和EHA105兩個(gè)菌株的轉(zhuǎn)化率分別為11.11％和18.18％。PCR擴(kuò)增結(jié)果證實(shí)，T-DNA已穩(wěn)定整合到GUS染色為陽性