農(nóng)桿菌介導的百合遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、百合是具有極高觀賞價值,廣泛用于切花、盆栽與庭院綠化的一類球根花卉。其新品種的選育和商品種球的供應是我國花卉產(chǎn)業(yè)上的一項迫切任務。百合的遺傳轉(zhuǎn)化工作起步較晚,但在近十年時間中取得了相當大的進展,然而真正利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的百合品種目前尚未見報道。
　　 本課題涉及百合穩(wěn)定高效再生體系的建立以及農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化兩大方面。目前取得的主要成果如下:
　　 1)摸索出了百合鱗片薄層切片的間接再生途徑,即先從鱗片薄層切片上誘導

2、出愈傷組織,再由愈傷組織分化出苗,最后使再生苗產(chǎn)生小鱗莖。實驗發(fā)現(xiàn),橫切薄層切片68.75％的愈傷組織誘導率明顯高于縱切薄層切片25.96％的愈傷組織誘導率。小鱗片各部位的愈傷組織誘導能力大小依次為:下部>中部>上部,其中下部的誘導率高達93.33％。而不同部位的愈傷組織進行再分化的能力也有差異,其中下部的愈傷組織再分化能力明顯高于上、中部。在光照/黑暗=16 h/8 h的條件下,誘導出來的愈傷組織褐化嚴重,且較早地分化出芽點；而在黑暗

3、條件下誘導出的愈傷組織沒有褐化,且培養(yǎng)早期不分化芽點。
　　 2)在‘耀眼黃’百合愈傷組織分化試驗中,不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上,愈傷分化出芽率最高,為90％。隨著BA濃度的提高,愈傷組織的褐化越來越嚴重。為了在轉(zhuǎn)化體的篩選過程中,快速比較不同轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)劣,應選擇不添加任何激素的MS培養(yǎng)基作為篩選分化的培養(yǎng)基。
　　 3)在組培苗鱗莖膨大的研究中發(fā)現(xiàn),隨著濃度的升高,ABA對產(chǎn)生小鱗莖的促進作用呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。

4、當.ABA濃度為0.05 mg/L時效果最好,分化出小鱗莖的苗數(shù)占95％。而當ABA濃度過高時,小鱗莖的再生反而受到抑制。隨著濃度的升高,ABA對小鱗莖膨大的促進作用呈現(xiàn)出先升后降的趨勢,當濃度為0.2 mg/L時效果最好,小鱗莖平均重約166 mg。
　　 4)百合鱗片的直接再生途徑的研究結(jié)果表明,90 g/L的蔗糖濃度最適于鱗莖的誘導及生長；再生鱗莖的大小隨著培養(yǎng)基中大量元素含量的升高而增加,1.5 MS培養(yǎng)基的效果最佳；在

5、培養(yǎng)基中同時添加1 mg/L BA與0.2 mg/L NAA可以顯著提高鱗片再生小鱗莖的數(shù)量；水楊酸對鱗片分化小鱗莖具有抑制作用；低濃度的多效唑?qū)[片再生的影響不明顯,高濃度時具有一定的抑制作用。綜合以上結(jié)果,確定鱗片再生與小鱗莖生長的最佳培養(yǎng)基為1.5 MS+1 mg/L BA+0.2 mg/L,NAA+90 g/L蔗糖。
　　 5)以‘耀眼黃’百合的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體時,確定卡那霉素選擇壓為75 mg/L。所轉(zhuǎn)化的目的基因包

6、括TA29-Barnase基因、35S-CBF3基因、百合LsAG基因的干涉載體(35S-LsAGRi)?！埸S’百合的愈傷組織顆粒細小,松散易碎,在侵染和共培后很容易褐化死亡,即使有成苗,苗子生活力也很差。在轉(zhuǎn)化35S-CBF3基因后得到8株抗性苗,其中6株P(guān)CR檢測為陽性；轉(zhuǎn)化TA29-Barnase基因后得到4株抗性苗,其中3株P(guān)CR檢測為陽性。
　　 6)以麝香百合鱗片薄層切片為轉(zhuǎn)化受體時,確定卡那霉素選擇壓亦為75