煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠保護(hù)作用及作用機(jī)制的研究.pdf

1、多發(fā)性硬化（MS）是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性脫髓鞘性疾病，其病理特點(diǎn)包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失和軸索損傷等。本病好發(fā)于中青年，其主要臨床特點(diǎn)為病灶的空間多發(fā)性以及時(shí)間多發(fā)性。MS呈慢性病程，復(fù)發(fā)率高，治療費(fèi)用高，致殘率高，但預(yù)后差，并且缺乏有效的治療措施，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大損失和負(fù)擔(dān)。
　　MS的病因復(fù)雜，涉及環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、病毒感染、遺傳因素等諸多原因。盡管其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)程度與

2、疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重 MS的發(fā)病，抑制炎癥反應(yīng)減輕MS的發(fā)病，Th1/Th17細(xì)胞平衡與Th2/Treg細(xì)胞平衡的紊亂對(duì)MS的發(fā)生起到了重要作用。
　　具體到免疫炎性反應(yīng)來(lái)說(shuō)，Th1/Th17細(xì)胞平衡與Th2/Treg細(xì)胞平衡的紊亂對(duì)MS和EAE的發(fā)生起到了重要作用。原始的CD4+T細(xì)胞受激活后可以分化為Th1、Th17、Th2和Treg細(xì)胞。這些細(xì)胞以分泌炎癥細(xì)胞因子的方式來(lái)參與炎癥反應(yīng)。其中Th1和Th17細(xì)

3、胞為致炎細(xì)胞，其產(chǎn)生 IFN-γ和 IL-17等細(xì)胞因子具有促炎作用。IL-12對(duì)于Th1細(xì)胞的產(chǎn)生起重要作用，IL-6對(duì)于Th17細(xì)胞的產(chǎn)生有重要影響。Th2和Treg細(xì)胞均屬于抑炎細(xì)胞，并且Th2和 Treg細(xì)胞可分泌IL-4、IL-10和 TGF-β等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)于自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展也起到了抑制作用。
　　實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是MS經(jīng)典的動(dòng)物模型。最近一些實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，生成炎癥介質(zhì)的過(guò)程是高耗

4、能的，炎癥反應(yīng)程度與細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)緊切相關(guān)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為一種調(diào)控細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵激酶，它可通過(guò)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)依賴的途徑發(fā)揮抗炎效應(yīng)。 AMPK/SIRT1能量敏感通路的激活對(duì)炎癥反應(yīng)有著重要而顯著的調(diào)控效應(yīng)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD+的參與對(duì)此通路起著重要作用。AMPK通過(guò)增加NAD+水平來(lái)激活SIRT1，活化的SIRT1則通過(guò)催化 NF-κB、AP-1和組蛋白的去乙酰化反應(yīng)來(lái)降低相關(guān)炎

5、癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，使炎癥相關(guān)因子含量減少，進(jìn)而調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)。
　　大量研究表明，NAD+在線粒體功能、能量代謝、基因表達(dá)、老化和鈣通道穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮重要作用。也有研究提出NAD+治療可降低由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，并且能夠調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞分化。這為我們探索NAD+對(duì)EAE的治療作用提供了初步的理論基礎(chǔ)。
　　在我們的研究中，我們利用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型，觀察給予NAD+干預(yù)

6、是否對(duì)于EAE具有保護(hù)作用，以及它對(duì)EAE模型中各輔助型T細(xì)胞比例和免疫炎癥反應(yīng)程度的影響，并對(duì)NAD+是否通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1通路來(lái)進(jìn)一步保護(hù)進(jìn)行研究
　　第一部分：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎保護(hù)作用的效果分析及病理學(xué)研究
　　目的:
　　建立經(jīng)典的小鼠多發(fā)性硬化動(dòng)物模型之后，使用NAD+進(jìn)行藥物干預(yù)，評(píng)估不同組別小鼠的發(fā)病情況，通過(guò)HE染色、WEIL染色等病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，從病理學(xué)層面觀

7、察NAD+對(duì)多發(fā)性硬化小鼠發(fā)生的相關(guān)病理改變的作用效果，研究NAD+能否改善多發(fā)性硬化形成的炎癥反應(yīng)、軸索損傷和髓鞘缺失。
　　方法：
　　1.選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用清潔級(jí)雌性C57BL／6小鼠，周齡大約為8-10周，體重大約為18-20g，小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。將小鼠飼養(yǎng)在恒溫恒濕的環(huán)境中，保持明、暗12小時(shí)交替循環(huán)，并保證小鼠擁有充足的飲水和食物。
　　2.建立EAE動(dòng)物模型。將MOG35-55多肽用生理鹽

8、水稀釋成10mg/ml，然后加入等體積的完全弗氏佐劑(CFA)和一定量的結(jié)核菌素相互混合形成油包水乳劑，最終使結(jié)核桿菌H37Ra濃度為4mg/ml，并于小鼠脊柱兩旁分4點(diǎn)皮下注射0.1ml的乳劑，之后分別在免疫第0天（0h）及第2天（48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）。
　　3.建立EAE動(dòng)物模型后，將EAE小鼠隨機(jī)分為EAE模型組和NAD+治療組，并同時(shí)取未免疫正常小鼠作為正常對(duì)照組。NAD+溶于磷酸鹽緩沖液中

9、，每日現(xiàn)配現(xiàn)用。自免疫后第1天（免疫當(dāng)日記作第0天）開始， NAD+組小鼠給予每日腹腔注射NAD+250mg/kg，正常對(duì)照組和EAE模型組小鼠則每日腹腔注射等量的磷酸鹽緩沖液。自免疫后的第1天，分別由兩名觀察者分兩次采用雙盲法于每天早晚（8:00和16:00）兩次對(duì)小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分并同時(shí)測(cè)量體重，直至觀察結(jié)束對(duì)小鼠進(jìn)行處死。神經(jīng)功能評(píng)分使用的是更為詳盡的Weaver（15分）法。
　　4.組織病理學(xué)觀察。小鼠使用水合氯醛進(jìn)行

10、麻醉，并使用4％多聚甲醛進(jìn)行灌注，取小鼠的脊髓腰膨大處行石蠟包埋處理，5μm厚度切片。在光鏡下，通過(guò)HE染色和WEIL兩種染色方法觀察小鼠脊髓腰膨大處炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失情況，每只小鼠選取3張脊髓組織進(jìn)行切片，并且每張切片分別選取5個(gè)高倍（400×）視野對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分定量處理，計(jì)算每只小鼠平均炎性評(píng)分。
　　5.免疫組化病理學(xué)觀察。小鼠使用水合氯醛麻醉，并用4%多聚甲醛灌注小鼠后，取小鼠脊髓腰膨大處制成石蠟切片

11、，5μm厚度切片。通過(guò)MBP和NF200染色，光鏡下觀察小鼠髓鞘脫失和軸索損傷情況。
　　6.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以―均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。發(fā)病率以百分?jǐn)?shù)表示，并用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床神經(jīng)功能評(píng)分用Mann–Whitney U檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

12、br>　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用NAD+進(jìn)行藥物干預(yù)，可以降低EAE小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分并改善臨床癥狀，還可以減少EAE小鼠的發(fā)病率，推遲起病時(shí)間；
　　2.應(yīng)用NAD+進(jìn)行藥物干預(yù)，可以抑制EAE小鼠的炎細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)，并且能夠起到保護(hù)髓鞘和降低軸索損傷的作用。
　　第二部分：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸能夠通過(guò)影響 T細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎起保護(hù)作用
　　目的:
　　使用MO

13、G35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立EAE的動(dòng)物模型，并用NAD+進(jìn)行干預(yù)，觀察NAD+治療組和EAE模型組各輔助性T細(xì)胞數(shù)量以及功能的變化，為NAD+對(duì)于EAE的保護(hù)作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化及功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用清潔級(jí)雌性C57BL／6小鼠，周齡大約為8-10周，體重大約為18-20g，小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。將小鼠飼養(yǎng)在恒溫恒濕的環(huán)境中，保持明、暗12小時(shí)交替循環(huán)，并保

14、證小鼠擁有充足的飲水和食物。
　　2.建立EAE動(dòng)物模型。將MOG35-55多肽用生理鹽水稀釋成10mg/ml，然后加入等體積的完全弗氏佐劑(CFA)和一定量的結(jié)核菌素相互混合形成油包水乳劑，最終使結(jié)核桿菌H37Ra濃度為4mg/ml，并于小鼠脊柱兩旁分4點(diǎn)皮下注射0.1ml的乳劑，之后分別在免疫第0天（0h）及第2天（48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2、Th17

15、細(xì)胞及Treg細(xì)胞的比例。在每個(gè)流式上樣管中加入細(xì)胞數(shù)大概為1×106個(gè)，體積為100μl的細(xì)胞懸液，用于檢測(cè)Th1、Th2、Th17細(xì)胞。用熒光單克隆抗體FITC-CD40.25μl標(biāo)記細(xì)胞表面抗體。而Treg細(xì)胞用熒光單克隆抗體FITC-CD40.25μl和APC-CD250.3μl標(biāo)記細(xì)胞表面抗體，室溫避光孵育30 min；破膜固定后加入PE-IFN-γ抗體1.25u1標(biāo)記胞內(nèi)IFN-γ，APC-IL-4抗體1.25u1標(biāo)記胞內(nèi)I

16、L-4，APC-IL-17A抗體0.625u1標(biāo)記胞內(nèi)IL-17，2.5μl PE-Foxp3標(biāo)記胞內(nèi)Foxp3，室溫避光孵育60min，F(xiàn)low Cytometry StainingBuffer洗滌并重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　4.采用ELISA的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)脾細(xì)胞上清培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的含量。我們收集脾胞上清液用于定量分析檢測(cè)IFN-γ,IL-17,TGF-β，IL-10，IL-6，IL-1β炎癥因子的含量。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格依

17、據(jù)各試劑盒的相關(guān)操作說(shuō)明書。
　　5.采用qPCR的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)T-bet,STAT3,RORγt,Foxp3,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β,IFN-γ,IL-2,IL-12和IL-17A表達(dá)情況。
　　6.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以―均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。

18、以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用NAD+干預(yù)，可以降低EAE小鼠Th1和Th17細(xì)胞比例。同正常對(duì)照組相比，EAE組小鼠的Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例顯著升高，而Th2和Treg細(xì)胞比例顯著下降，而NAD+治療組小鼠Th1和Th17細(xì)胞比例較 EAE小鼠相比明顯下降，用RT-PCR方法檢測(cè)STAT3、RORγ和 T-bet mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。在EAE組小鼠脾細(xì)胞中，STAT3、RORγ和T-

19、bet mRNA轉(zhuǎn)錄水平比空白對(duì)照組顯著增高，而NAD+組STAT3、RORγT和T-bet mRNA轉(zhuǎn)錄水平較EAE組降低；
　　2.應(yīng)用NAD+干預(yù)，可以降低Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的特征性炎癥細(xì)胞因子的含量。采用ELISA的方法并在發(fā)病高峰期取材，我們發(fā)現(xiàn)在EAE組小鼠中，IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ含量與正常對(duì)照組相比顯著增高,而 NAD+治療組的IL-1β、IL-6、IL-17A和IFN-γ的含量與EA

20、E組小鼠相比顯著減低，在EAE組小鼠中，IL-10和TGF-β含量與正常對(duì)照組相比顯著降低， NAD+治療組IL-10和TGF-β含量與EAE小鼠組相比顯著增高；
　　3.應(yīng)用NAD+干預(yù)，可以降低Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的特征性炎癥因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。采用RT-PCR的方法并在小鼠發(fā)病高峰期取材，我們發(fā)現(xiàn)在EAE組小鼠中，IL-1β、IL-6、IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-17A mRNA轉(zhuǎn)錄水平與正常對(duì)照組相比顯

21、著增高，而NAD+治療組中IL-1β、IL-6、IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-17A mRNA轉(zhuǎn)錄水平較EAE組小鼠顯著減低，而在EAE組小鼠中，IL-10和TGF-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與正常對(duì)照組相比顯著降低，NAD+治療組中IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較EAE組顯著增高。
　　第三部分：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1通路發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)自身免疫性腦脊髓炎的保護(hù)作用
　　目的:
　　使用MOG3

22、5-55建立C57BL/6小鼠的EAE動(dòng)物模型，并用NAD+進(jìn)行干預(yù)，采用Western blot方法測(cè)定小鼠AMPK磷酸化程度、P65磷酸化程度和SIRT1蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步闡述NAD+治療 EAE的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用清潔級(jí)雌性C57BL／6小鼠，周齡大約為8-10周，體重大約為18-20g，小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。將小鼠飼養(yǎng)在恒溫恒濕的環(huán)境中，保持明、暗12小時(shí)交替循環(huán)，并保

23、證小鼠擁有充足的飲水和食物。
　　2.建立EAE動(dòng)物模型。將MOG35-55多肽用生理鹽水稀釋成10mg/ml，然后加入等體積的完全弗氏佐劑(CFA)和一定量的結(jié)核菌素相互混合形成油包水乳劑，最終使結(jié)核桿菌H37Ra濃度為4mg/ml，并于小鼠脊柱兩旁分4點(diǎn)皮下注射0.1ml的乳劑，之后分別在免疫第0天（0h）及第2天（48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）。
　　3.用Western blot方法法檢測(cè)AMP

24、Kα、phospho-AMPKα、SIRT1、P65、phospho-P65的蛋白表達(dá)情況。
　　4.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以―均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用NAD+干預(yù)，能夠激活A(yù)MPK/SIRT1通路從而對(duì)EAE

25、小鼠起保護(hù)作用。在疾病高峰期，EAE組小鼠p-AMPK和SIRT1蛋白的表達(dá)含量同正常對(duì)照小鼠相比顯著降低，而NAD+治療組小鼠p-AMPK和SIRT1蛋白的表達(dá)含量同EAE組小鼠相比明顯增高；
　　2.應(yīng)用NAD+干預(yù)，可以降低p-p65蛋白的表達(dá)含量。在疾病高峰期，EAE組小鼠p-p65蛋白的表達(dá)含量同正常對(duì)照小鼠相比顯著增高，而NAD+治療組小鼠p-p65蛋白的表達(dá)含量同EAE組小鼠相比明顯降低。
　　結(jié)論：