α-硫辛酸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索損傷的保護作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multipie sclerosis,MS)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脫髓鞘疾病。長期以來一直認為MS是以CNS廣泛的髓鞘脫失而軸索結構相對保存為特征的原發(fā)性脫髓鞘癇變。直到上世紀九十年代末期國外學者證實在MS急性和慢性病灶中均存在軸索損傷,受損軸索多存在于硬化斑內或其邊緣,在大體形態(tài)正常的白質中也有少量的軸索破壞。病灶中的軸索損害引起wanerina變性,導致軸索

2、缺失。目前認為軸索變性或損害是MS主要病理改變之一,在病程早期就開始發(fā)生,而且可能是導致臨床上出現(xiàn)進行性神經功能障礙的主要因素。軸索損傷的程度與病情的嚴重程度相關。因此,目前對于多發(fā)性硬化軸索損傷機制以及相關的軸索損傷保護作用的探索正成為研究的熱點。
　　 軸索損害的原因和確切機制目前仍不清楚。目前一些國內外研究表明:氧化應激在MS的發(fā)病中起了非常重要的作用。氧化應激反應產生的氧自由基及其他代謝產物可氧化體內的生物大分子,誘發(fā)自

3、由基鏈式反應,產生大量脂質過氧化產物,造成生物膜損傷,各種亞細胞器結構破壞,酶活性降低或消失,引起細胞自溶。
　　 α-硫辛酸作為一種強的抗氧化劑,已引起人們的廣泛重視。它屬于維生素B類化合物,是一種天然抗氧化劑。它主要通過清除自由基,螯合金屬離子,再生其他抗氧化劑而來發(fā)揮其抗氧化作用。在國外,它通過干預氧化應激過程,減少自由基對血管和神經的損傷作用而被用于治療糖尿病周圍神經病變并且已取得了較好的療效。但目前國內外對α-硫辛酸及

4、于多發(fā)性硬化的研究很少,關于α-硫辛酸對MS軸索損傷是否具有保護作用。尚不清楚。
　　 本實驗通過建立多發(fā)性硬化模型-實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),檢測大鼠發(fā)病過程中軸索損傷相關指標,了解MS發(fā)病過程中軸索損傷情況。通過α-硫辛酸對EAE大鼠的干預來觀察軸索損傷指標的相應變化,了解對軸索損傷的保護作用,從而為臨床治療MS提供新的思路和實驗依據。
　　 方法:
　　 1動物分組:將80只成年健康雌性Wista

5、r大鼠,體重180～200g,隨機分出正常對照組(NC組)6只,其余用新鮮豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)誘導免疫,待第一次發(fā)病后隨機選出發(fā)病組(DIS組)大鼠6只,其余平均分為EAE組、硫辛酸組(LA組,100mg·kg-1·d-1)和地塞米松組(DXM組,2mg·kg-1·d-1)。其中EAE和各藥物干預組再按病程分為緩解組(REM組)、復發(fā)組(REL組)兩個亞組,每亞組6只,藥物干預組動物無復發(fā)者,按預實驗中統(tǒng)計的EAE組動物緩解復發(fā)

6、平均天數(shù)分為干預后7天組(LA7d組:DXM7d組)和干預后14天組(LA14d組;DXM14d組)。
　　 2模型制備:將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿,加上等量完全福氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)制成完全免疫抗原。0.5 ml/只,分別于大鼠四肢足墊和背部皮下注射。藥物治療組于動物發(fā)病后第一天起給予相應劑量腹腔注射,連續(xù)注射7天。
　　 3神經功能評分:于免疫誘導當日及免疫后每天對動物

7、的體重變化、精神狀態(tài)、活動情況進行觀察,并對動物進行神經功能評分,采用國際通用的Kono評分標準,分為5分:1分動物尾部無力;2分尾部無力+肢體無力;3分肢體輕度麻痹;4分肢體嚴重麻痹,被動翻身后不能復原:5分瀕死狀態(tài)或死亡。
　　 4組織病理學:在動物麻醉狀態(tài)下,快速取其脊髓腰膨大組織,4％多聚甲醛固定,石蠟包埋,組織切片。行改良的三色染色和改良Bielschowsky銀染色,光學顯微鏡下觀察病理學改變。
　　 5免疫

8、組織化學染色:取動物脊髓腰膨大處組織,石蠟包埋,做6μm橫截面切片,血清封閉,分別加神經絲蛋白(NF,Neurofilament protein)和β-淀粉樣前體蛋白(β-APP,β-amyloid precursor protein)的一抗,經二抗、三抗孵育,DAB顯色,蘇木精復染,脫水透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察NF和β-APP的表達情況。
　　 6β-APP的免疫印跡(Western Blot):動物麻醉狀態(tài)下,迅

9、速取脊髓腰膨大處組織置于-80℃冰箱內備用。提取蛋白,電泳,轉膜,封閉,加一抗,洗膜,加二抗,洗膜,顯色。圖像采集,數(shù)據分析。
　　 結果:
　　 1動物復發(fā)情況觀察:EAE組動物復發(fā)率58.3％,LA組動物復發(fā)率8.3％,DXM組動物無復發(fā)。LA組、DXM組復發(fā)率均小于EAE組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。LA組與DXM組之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2動物行為學觀察:在動物緩解期(發(fā)病后第7天)

10、和復發(fā)期(發(fā)病后第14天)時神經功能評分比較:(1)緩解期:LA組、DXM組評分均小于EAE組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),LA組與DXM組之間評分比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);(2)復發(fā)期:LA組、DXM組評分均小于EAE組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),LA組、DXM組之間評分比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3組織病理學觀察:
　　 3.1改良三色染色:
　　 結果顯示:正常對照組軸索絕大多數(shù)

11、粗細均勻,走行方向較一致,軸索的連續(xù)性完好。余各組均不同程度出現(xiàn)軸索改變,可見軸突腫脹、增粗、彎曲,著色不均,呈鋸齒狀或串珠狀,不連續(xù),甚至斷裂。髓鞘結構層次紊亂,疏松,崩解;
　　 3.2改良Bielschowsky銀染色:
　　 結果顯示:正常對照組軸索絕大多數(shù)粗細均勻,走行方向較一致,軸索的連續(xù)性完好。余各組均不同程度出現(xiàn)軸索改變,包括軸索腫脹、粗細不均、畸形,部分出現(xiàn)空泡狀淡染,有的甚至出現(xiàn)斷裂,部分形成收縮球。

12、
　　 4免疫組織化學染色:
　　 4.1脊髓組織中NF表達:
　　 結果顯示:正常組NF表達量最多;與正常組相比,發(fā)病期NF表達量減少,緩解期表達量有所增加,復發(fā)期表達量再次減少,差異均有顯著性,p＜0.05;經LA和DXM藥物干預后NF表達量有所增加,差異有顯著性,p＜0.05。
　　 4.2脊髓組織中β-APP表達:
　　 結果顯示:正常組β-APP有所表達,但量很少;與正常組相比,發(fā)病期β

13、-APP表達量增多,緩解期表達量有所減少,復發(fā)期表達量再次增多,差異均有顯著性,p＜0.05;經LA和DXM藥物干預后β-APP表達量有所下降,差異有顯著性,p＜0.05。
　　 5脊髓組織中β-APP的免疫印跡結果:正常組β-APP有所表達,但量很少;與正常組相比,發(fā)病期β-APP表達量增多,緩解期表達量有所減少,復發(fā)期表達量再次增多,差異均有顯著性,p＜0.05;經LA和DXM藥物干預后β-APP表達量有所下降,差異有顯著性

14、,p＜0.05。結果與β-APP的免疫組織化學的結果相一致。
　　 結論:
　　 1硫辛酸可以促進EAE大鼠的病情緩解,降低動物復發(fā)率。
　　 2通過改良三色染色和改良的Bielschowsky銀染色法,均可見在EAE大鼠中存在軸索損傷的病理改變。
　　 3 EAE大鼠脊髓組織中β-APP和NF的表達均與病情活動性相關,隨病程發(fā)展呈一定的變化趨勢,藥物干預對各指標有一定影響。
　　 4硫辛酸對EA