胎盤生長(zhǎng)因子源性正電荷多肽增強(qiáng)γ-干擾素抑制人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、人腦惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，由于其具有惡性程度高和侵襲能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因此臨床治愈困難、預(yù)后差、病變致死率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)過(guò)綜合治療后惡性腦膠質(zhì)瘤患者的存活中位數(shù)時(shí)間僅為15個(gè)月1。目前治療惡性腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法主要包括外科切除，放射治療，化學(xué)藥物治療或者這幾種治療方法的聯(lián)合使用2，這些治療措施在一定程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了患者的生命，但是這些方法終究不能徹底消滅腫瘤細(xì)胞，并且惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度高，侵襲

2、能力強(qiáng)，即使經(jīng)過(guò)上述綜合治療，往往還是容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，造成預(yù)后效果不佳。因此尋找一種新的方法輔助治療惡性膠質(zhì)瘤，提高治療預(yù)后效果是非常必要的。
　　γ－干擾素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)備受關(guān)注，由于其具有多種生物活性，因此受到科學(xué)家的青睞，它的生物活性包含抑制腫瘤生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)的作用，這些活性作用給腫瘤研究人員尋找抑制腫瘤生長(zhǎng)試劑提供了一個(gè)理想的選擇。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)γ－干擾素能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞分化并且通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答從而間接

3、抑制腫瘤的進(jìn)展，目前作為一種輔助制劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療癌癥患者3、4、5。但是在臨床使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)γ－干擾素的半衰期太短，有實(shí)驗(yàn)報(bào)道在人體內(nèi)經(jīng)靜脈注射的γ－干擾素半衰期時(shí)間大約為30分鐘，經(jīng)肌肉注射其半衰期時(shí)間大約為4.5小時(shí)，通過(guò)γ－干擾素基因治療可以維持血漿內(nèi)γ－干擾素的濃度，但是γ－干擾素受體在體內(nèi)的廣泛表達(dá)限制了其特異性治療作用，造成了抗腫瘤作用的低效性，但是控制γ－干擾素在組織內(nèi)的分布可以部分解決這一問(wèn)題6、7。因此重新設(shè)計(jì)

4、一種γ－干擾素融合蛋白減少其細(xì)胞毒性引起的副作用，增強(qiáng)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力是目前可行的方法。在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谠鸡茫蓴_素 DNA序列的3’端添加一段來(lái)自于胎盤生長(zhǎng)因子的正電荷多肽以形成新的γ－干擾素融合蛋白 DNA序列，該融合蛋白我們稱之為合成的γ－干擾素（Synthetic Interferon?，SIFγ）。為了驗(yàn)證新合成的融合蛋白對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，我們將該融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合包裝質(zhì)粒和信封質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至29

5、3T細(xì)胞，收集293T細(xì)胞產(chǎn)生的慢病毒，使用慢病毒感染至人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87細(xì)胞系，然后通過(guò)嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)新合成的γ－干擾素融合蛋白的 U87細(xì)胞系，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的各項(xiàng)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比較，從而研究該正電荷多肽片段是否能夠增強(qiáng)野生型γ－干擾素抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，并且檢測(cè)γ－干擾素下游通路各干擾素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)狀況，這些研究為新合成的γ－干擾素在腫瘤抑制方面的應(yīng)用提供了一個(gè)有效可行的方向。本實(shí)驗(yàn)主要包含以下三個(gè)

6、部分。
　　第一部分 SIFγ質(zhì)粒的構(gòu)建及其在 U87細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)的研究
　　目的：構(gòu)建 SIFγ表達(dá)質(zhì)粒并且研究其在人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的可行性。
　　方法：通過(guò) RT-PCR方法獲得γ－干擾素 cDNA和胎盤生長(zhǎng)因子內(nèi)正電荷多肽DNA編碼序列，用 PCR方法將兩者連接起來(lái)，通過(guò)分子克隆方法將其連接在含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素雙選擇標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)，擴(kuò)增后通過(guò)酶切鑒定。將驗(yàn)證正確的 SIFγ質(zhì)粒聯(lián)合包裝質(zhì)粒

7、和信封質(zhì)粒采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收集濃縮產(chǎn)生的 SIFγ慢病毒顆粒感染U87細(xì)胞，通過(guò)內(nèi)置的雙選擇標(biāo)記篩選出穩(wěn)定表達(dá) SIFγ的 U87細(xì)胞。并且設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，采用相同的方法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒的 U87細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了SIFγ表達(dá)質(zhì)粒，并且篩選出穩(wěn)定表達(dá)SIFγ的U87細(xì)胞系。
　　結(jié)論：新構(gòu)建的SIFγ表達(dá)質(zhì)粒能夠在U87細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，為下一步研

8、究在腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)SIFγ對(duì)細(xì)胞增殖的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 SIFγ對(duì)U87細(xì)胞增殖活性的影響
　　目的：研究 SIFγ對(duì) U87細(xì)胞系增殖活性的影響，并且觀察 SIFγ聯(lián)合替莫唑胺治療惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果。
　　方法：通過(guò) MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力，腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤侵襲性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，SIFγ組細(xì)胞活

9、性明顯降低，克隆形成能力明顯減弱，其跨膜侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞周期各期無(wú)明顯改變，細(xì)胞凋亡明顯增多，并且與替莫唑胺聯(lián)合培養(yǎng)的SIFγ組對(duì)替莫唑胺的敏感性明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：與對(duì)照組和 IFNγ組相比較，胎盤生長(zhǎng)因子源性的正電荷多肽能夠增強(qiáng)野生型γ－干擾素抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物活性作用，并且能夠增強(qiáng)與替莫唑胺聯(lián)合使用產(chǎn)生的協(xié)同作用，進(jìn)而可以減少替莫唑胺的使用劑量以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用，從而減輕其副作用

10、。
　　第三部分 SIFγ對(duì)γ－干擾素下游信號(hào)通路的影響
　　目的：研究SIFγ與野生型IFNγ相比較，對(duì)于激活下游JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能力的影響。
　　方法：使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi) IFNγ下游信號(hào)通路GAS位點(diǎn)的激活狀態(tài)，通過(guò) RT-PCR方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi) IFNγ調(diào)節(jié)基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1的表達(dá)狀況，采用Western Blotting方法在蛋白

11、水平檢測(cè)IFN?調(diào)節(jié)基因蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比， SIFγ組細(xì)胞內(nèi) IFNγ調(diào)節(jié)基因 CLDN7、ISG15、SERPINB1和 STAT1在基因水平和蛋白水平上表達(dá)均明顯增加，并且下游JAK/STAT信號(hào)通路激活狀態(tài)明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：新合成的 SIFγ融合蛋白激活 IFNγ下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即 JAS/STAT信號(hào)通路的能力明顯增強(qiáng)。 SIFγ激活 JAK/STAT信號(hào)通路的機(jī)制應(yīng)該與野生型γ－干擾素相