Semaphorin3G對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用研究.pdf

1、目的:研究U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中人信號(hào)素3G基因(SEMA3G)的表達(dá)情況;觀察轉(zhuǎn)染SEMA3G基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響,從而為膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù),為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.分組:實(shí)驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pEGFP-NI-SEMA3G,SEMA3G-GFP組)、空載體組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1,GFP組)、空白對(duì)照組(Control組)。
　　 2.應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)

2、體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將外源性的SEMA3G基因?qū)險(xiǎn)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),加入1000μg/ml的遺傳霉素(G418)進(jìn)行抗性篩選培養(yǎng),每隔3～4天換液一次,維持抗性篩選4周,獲得相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的克隆株細(xì)胞。
　　 3.運(yùn)用Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)、Western blot(WB)等方法鑒定外源性的SEMA3G基因

3、在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 4.應(yīng)用噻唑蘭(Methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法,檢測(cè)SEMA3G對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 5.使用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometer,FCM)檢測(cè)SEMA3G對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.SEMA3G-GFP組和GFP組細(xì)胞經(jīng)G418抗性篩選14天之后,出現(xiàn)產(chǎn)生抗性的克隆團(tuán),倒置熒光顯微鏡下

4、觀察,可見(jiàn)部分細(xì)胞帶有綠色熒光標(biāo)記。
　　 2.RT-PCR、WB方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):GFP組和Control組中SEMA3G表達(dá)很弱,而SEMA3G-GFP組中SEMA3G基因高表達(dá)。
　　 3.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):瞬時(shí)轉(zhuǎn)染72、96小時(shí)和篩選4周后各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96小時(shí))SEMA3G-GFP組細(xì)胞的吸光度值(OD值)均低于GFP組和Control組。
　　 4.FCM檢測(cè)結(jié)果:SEMA3G基因轉(zhuǎn)染使

5、G1期細(xì)胞比例降低,S期比例增高,推測(cè)SEMA3G基因主要作用于G1期和S期。
　　 結(jié)論: SEMA3G mRNA在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)很弱,幾乎檢測(cè)不到。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染結(jié)合G418篩選的方法,可使U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)外源性SEMA3G。SEMA3G可使U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1期細(xì)胞比例降低,S期比例增高:且SEMA3G的U25l膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖率下降。故認(rèn)為SEMA3G基因可影響U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期,