shRNA干擾survivin基因誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡及抑制其增殖的實驗研究.pdf

1、背景:膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,約占成人顱內(nèi)腫瘤的40％～50％,傳統(tǒng)的手術(shù)、化療及放療等治療效果較差。伴隨著對膠質(zhì)瘤發(fā)生機制的深入研究以及分子生物學(xué)技術(shù)的日新月異,分子靶向治療逐漸成為一種有廣闊前景的治療腫瘤的新手段。
　　 Survivin是Ambrosini等利用效應(yīng)細胞蛋白酶受體-1(EPR-1)cDNA從人類基因庫中雜交篩選克隆出來的[1]。是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor ofapoptosis f

2、amily of protein,IAPs)的成員之一,人survivin基因全長1417kb,位于17q25,分子量16.4kD。編碼產(chǎn)生一個由142個氨基酸組成的具有獨特結(jié)構(gòu)的胞漿蛋白,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分子量最小、抗凋亡作用最強的IAP。Survivin在胚胎組織中普遍表達,在成人正常分化組織中(胸腺、生殖器除外)卻不表達或表達很低[2],而在腫瘤組織中卻過度表達。有研究發(fā)現(xiàn)survivin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和預(yù)后有關(guān),抑制其

3、表達能顯著促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡,抑制細胞增殖,而對正常組織無明顯影響。因而有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的理想靶點。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是生物體中普遍存在的、細胞本身固有的對抗外源基因侵害的一種自我保護現(xiàn)象。外源性或內(nèi)源性雙鏈DNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞后,首先被RNA酶Ⅲ家族成員中一種稱為dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNA specific endonuclease,Dicer)降解成2

4、1～23核苷酸(nucleotide,nt)的小片斷即小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)并以其為模板,特定位點、特定間隔降解與之序列相應(yīng)的mRNA,從而引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)。
　　 RNAi技術(shù)具有高效性、高特異性、高穩(wěn)定性,此外還具有有放大效應(yīng),所謂放大效應(yīng)即被降解的mRNA片段及未被降解的完整mRNA均可作為

5、引物,在RNA依賴的RNA聚合酶作用下,合成更多的dsRNA。新合成的dsRNA進入下一輪RNAi循環(huán)。RNAi技術(shù)作為新興的基因表達阻斷技術(shù),目前已成功用于基因功能和腫瘤相關(guān)基因等方面的研究,為臨床上特異性的基因干預(yù)治療腫瘤開辟了一條新的途徑。
　　 因此,利用RNAi技術(shù)研究survivin基因誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡及抑制細胞增殖不失為基因靶向治療膠質(zhì)瘤的好方法。
　　 目的:觀察shRNA干擾survivin基因?qū)δX膠

6、質(zhì)瘤細胞株U251凋亡及增殖的影響,并初步研究了survivin與微小染色體維持蛋2(minichromosomemaintenance proteins2,MCM2)之間的關(guān)系,為靶向survivin基因治療膠質(zhì)瘤提供理論和實驗依據(jù)。從而為攻克膠質(zhì)瘤這一頑癥提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)對膠質(zhì)瘤細胞株U251轉(zhuǎn)染survivin shRNA質(zhì)粒PG-surq(pGenesil-su

7、vrivin)以及無意義序列shRNA質(zhì)粒PG。設(shè)未轉(zhuǎn)染siRNA的U251細胞組為空白對照組,轉(zhuǎn)染無意義序列的U251細胞組為實驗對照組,轉(zhuǎn)染干擾序列的U251細胞組為實驗組。
　　 1采用RT-PCR和western-blot等方法分別檢測三組survivin的mRNA和蛋白水平表達情況,以證實shRNA對survivin的抑制效果;
　　 2流式細胞術(shù)(FCM)定量測定各組細胞的細胞周期和細胞凋亡變化;
　　

8、 3 MTT法檢測細胞增殖能力;
　　 4原位末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察各組細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征;
　　 5采用RT-PCR、western-blot分別檢測轉(zhuǎn)染survivin前后細胞MCM2mRNA和蛋白表達情況;
　　 6實驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SASv8.0軟件進行分析。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染siRNA后膠質(zhì)瘤細胞survivin表達明顯降低(P＜0.05),抑制率在90％左右。且轉(zhuǎn)染48h后抑制效果最佳

9、,各組轉(zhuǎn)染U251細胞48h后,熒光倒置顯微鏡下各組可見大量熒光細胞;FACS檢測各組轉(zhuǎn)染效果,各組轉(zhuǎn)染效率均為85％上下。
　　 1流式細胞儀分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siRNA后,U251細胞發(fā)生了顯著的凋亡(F=20.85,P=0.002＜0.01),細胞凋亡百分比37.9113±6.8134％;
　　 2原位末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察轉(zhuǎn)染PG-sur質(zhì)粒的細胞凋亡增多;
　　 3 MTT法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后2

10、4h、48h細胞增殖能力無明顯差異,72h、96h細胞增殖明顯減低;
　　 4 PI染色流式細胞周期檢測分析顯示,轉(zhuǎn)染干擾序列組細胞周期顯著阻滯于G2/M期;
　　 5轉(zhuǎn)染干擾序列后的U251細胞,MCM2的mRNA和蛋白表達顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 1 survivin基因在膠質(zhì)瘤細胞株U251中具有抗細胞凋亡作用;
　　 2 survivin基因在膠質(zhì)瘤細胞株U251中促進腫瘤細胞的增殖