膽紅素氧化酶的制備及應(yīng)用.pdf

1、膽紅素氧化酶（bilirubin-oxidase，簡(jiǎn)寫為BOD，EC.1.3.3.5）是一種臨床診斷用酶，通過(guò)它檢測(cè)人體內(nèi)膽紅素水平可判斷是否患有肝臟等疾病。
　　 本實(shí)驗(yàn)以露濕漆斑菌（Myrothecium roridum，MTR）為原材料，經(jīng)過(guò)冷凍干燥濃縮，DEAE-Sepharose陰離子交換層析對(duì)MTR BOD進(jìn)行了分離純化，獲得電泳純。實(shí)驗(yàn)測(cè)定其分子量約為51kD、等電點(diǎn)為4.5，希夫試劑染色證明其為糖蛋白。這些生化特

2、性都與疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria，MV） BOD不同，而且穩(wěn)定性更佳。
　　 根據(jù)Genbank中MV BOD基因和多酚氧化酶的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用PCR從MTR的染色體DNA中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1.2kb的基因片段。通過(guò)序列比對(duì)，MTR BOD與MV BOD基因相似性可達(dá)95.35％。
　　 本實(shí)驗(yàn)還建立了一活性染色法，該方法通過(guò)BOD能夠特異地將膽紅素氧化成膽綠素的原理，利用酶與底物

3、的特異反應(yīng)，可以在凝膠上進(jìn)行底物染色來(lái)直接顯示酶的活性區(qū)帶。這種活性染色可以采用膽紅素直接溶入分離膠后電泳（膽紅素-PAGE），也可以在電泳后置于膽紅素溶液中染色（PACE-膽紅素）。其中PAGE-膽紅素方法在20min后即在凝膠上出現(xiàn)深綠色的BOD條帶，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠上的綠色酶條帶逐漸擴(kuò)散，最終形成透明條帶；而運(yùn)用膽紅素-PAGE的方法則在12h后才能在凝膠上看見透明的BOD所在的條帶。相比之下，前者更為簡(jiǎn)便、快速、靈敏。