膽紅素氧化酶誘導產生、分離純化及對染料降解的研究.pdf

1、疣孢漆斑菌代謝產生的胞外膽紅素氧化酶(EC.1.3.3.5)是一種含銅的多酚氧化酶,能氧化膽紅素和多種漆酶底物,在環(huán)境保護領域有較大的應用潛力。本文對疣孢漆斑菌產膽紅素氧化酶的發(fā)酵條件和胞外膽紅素氧化酶的純化及其對染料脫色等方面進行了研究。
　　 探索疣孢漆斑菌的最佳培養(yǎng)條件為:發(fā)酵培養(yǎng)時間4天、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基初始pH6.0、孢子液稀釋度10-3、250mL的三角瓶裝100 mL發(fā)酵液、土豆汁濃度20％時菌體產酶最佳。采

2、用單因素實驗和正交實驗相結合的方法,研究培養(yǎng)基中C源、N源、金屬離子及誘導劑對疣孢漆斑菌產酶的影響。結果表明在產酶培養(yǎng)基中,葡萄糖和大豆蛋白胨為最適C源和N源,添加2 mmol/L銅離子和0.1 mmol/L的誘導劑均可以提高發(fā)酵液的酶活。正交實驗得到的優(yōu)化組合為:葡萄糖10 g/L,大豆蛋白胨7.5 g/L,CuSO41 mmol/L,沒食子酸0.1 mmol/L,優(yōu)化后發(fā)酵液酶活提高了3倍。
　　 經過硫酸銨鹽析、透析、DE

3、AE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾等一系列純化步驟從350 mL粗酶液中得到2.43 mg純化的膽紅素氧化酶,最終純化倍數為3.12,總活力回收率為27.92％。由SDS-PAGE電泳圖片計算得出純酶的分子量為68.1kDa,Native PAGE電泳圖片是單一條帶,所得的純酶具有較高的純度。Native PAGE電泳中ABTS染色和膽紅素染色說明純酶可以氧化兩種底物,靛紅染色表明純酶可以有效

4、地使染料靛紅脫色。純酶的N端氨基酸序列和飛行質譜(MALDI-TOF-MS)的結果與已報道疣孢漆斑菌的N端氨基酸序列完全一致,N端氨基酸序列為VAQISPQYPMFTVPL。
　　 純酶用膽紅素為底物測得最適反應pH7.5,最適反應溫度為40℃;以ABTS為底物最適pH為3.4;純酶25℃時在pH7.5～8.0的緩沖液中保溫1 h較穩(wěn)定;最適pH下純酶在40℃以下保溫1 h酶活較穩(wěn)定。純化后的膽紅素氧化酶能催化氧化膽紅素和ABT

5、S兩種底物,但對膽紅素的親和性較好,氧化速度也更快。1 mmol/L半胱氨酸、10 mmol/L的NaN3和1mmol/L二硫疏糖醇對膽紅素氧化酶活力有強烈的抑制。大多數金屬離子對酶反應具有抑制作用或影響效果不明顯,但銅離子可以提高酶活力。
　　 共培養(yǎng)體系表明疣孢漆斑菌可以降解多種染料。疣孢漆斑菌對染料靛紅的降解過程是生物吸附(菌體吸附)和生物降解(酶降解)共同作用的結果,液體培養(yǎng)7天靛紅的脫色率達到90％以上。初步純化的膽紅