FABP3和MLCK3參與左心室壁跨壁異質(zhì)性調(diào)節(jié)的機(jī)制.pdf

1、目的：心臟中不同區(qū)域的心肌細(xì)胞收縮的協(xié)同性(coordinated contrac-tion)是維持正常心臟泵血功能必不可少的因素。左心室壁的心肌細(xì)胞可按所處位置不同分為兩部分：心外膜下層(Sub-epicardium, EPI)心肌細(xì)胞和心內(nèi)膜下層(Sub-endocardium, ENDO)心肌細(xì)胞。左心室壁的去極化是從ENDO側(cè)向EPI側(cè)傳導(dǎo)，ENDO心肌細(xì)胞負(fù)責(zé)左心室的起始收縮，因此，相比于EPI心肌細(xì)胞，ENDO心肌細(xì)胞的收縮

2、要對(duì)抗更大的室內(nèi)壓；而稍晚收縮的EPI心肌細(xì)胞則需要更短暫地收縮來維持左心室收縮的同步性。破壞左室收縮的同步性勢(shì)必降低左室泵血效率。從功能正常的左心室中分離的單獨(dú)ENDO心肌細(xì)胞的收縮性能要強(qiáng)于EPI心肌細(xì)胞，但其具體機(jī)制尚不明朗。
　　心肌細(xì)胞的收縮能力主要受胞漿內(nèi)鈣離子濃度[1]和肌小節(jié)蛋白(sarcomeric proteins) 活性的調(diào)節(jié)。最新的科研進(jìn)展表明，脂肪酸結(jié)合蛋白3（Fatty-acid-binding pro

3、tein 3, FABP3），能夠抑制大鼠心肌細(xì)胞的鈣釋放。FABP3在心肌組織中高表達(dá)，參與脂質(zhì)代謝，維持心臟能量供應(yīng)。我們的前期數(shù)據(jù)提示左心室壁內(nèi)的FABP3蛋白表達(dá)水平存在跨壁異質(zhì)性（EPI >ENDO），但是FABP3是否參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮能力的跨壁異質(zhì)性尚不清楚。
　　MLCK3(myosin light chain kinase3)是心肌特異型肌球蛋白輕鏈激酶，于2008年首次被發(fā)現(xiàn)于小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)。肌球蛋白輕鏈的磷

4、酸化會(huì)增加心肌細(xì)胞收縮的鈣敏感性以及加快心肌細(xì)胞收縮的動(dòng)力學(xué)。已有研究表明肌球蛋白輕鏈的磷酸化在左心室室壁的不同區(qū)域中存在異質(zhì)性（EPI>ENDO），但是MLCK3的蛋白表達(dá)水平是否存在異質(zhì)性，以及是否存在跨壁異質(zhì)性尚不清楚。
　　綜上所述，我們提出如下假設(shè)：FABP3和MLCK3的跨壁異質(zhì)性參與左心室壁心肌細(xì)胞收縮跨壁異質(zhì)性的形成。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　以本

5、實(shí)驗(yàn)室使用健康C57BL/6小鼠，雄性，8-10周齡。飼于SPF級(jí)環(huán)境中。
　　2.Western blot檢測(cè)心肌EPI和ENDO組織的FABP3，MLCK3的蛋白表達(dá)
　　3.用 IonOptix單細(xì)胞動(dòng)緣檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)EPI和ENDO心肌細(xì)胞的收縮功能
　　4.通過鈣成像技術(shù)研究小鼠左室心肌細(xì)胞鈣瞬變的動(dòng)力學(xué)變化。
　　5.觀察給藥FABP3條件下EPI和ENDO細(xì)胞鈣火花的測(cè)量
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和相

6、關(guān)分析
　　數(shù)據(jù)用MEAN±SE表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，檢驗(yàn)以P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.驗(yàn)證C57BL/6小鼠左室心肌細(xì)胞收縮能力的跨壁異質(zhì)性
　　1.1.ENDO心肌細(xì)胞的收縮幅度顯著高于EPI心肌細(xì)胞，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，EPI心肌細(xì)胞的收縮能力顯著性小于ENDO心肌細(xì)胞。
　　1.2.對(duì)左室EPI與ENDO心肌細(xì)

7、胞收縮速率的比較，EPI心肌細(xì)胞的最大收縮速率略小于ENDO心肌細(xì)胞，但兩組數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該數(shù)據(jù)提示，EPI心肌細(xì)胞與ENDO心肌細(xì)胞的收縮速率基本一致。
　　1.3.我們測(cè)量了EPI心肌細(xì)胞與ENDO心肌細(xì)胞的從收縮起始達(dá)到最大收縮幅度的時(shí)程(達(dá)峰時(shí)間)。EPI心肌細(xì)胞的達(dá)峰時(shí)間小于ENDO心肌細(xì)胞，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，小鼠心肌左室壁內(nèi)，EPI心肌細(xì)胞收縮時(shí)程短于ENDO心肌細(xì)胞。<

8、br>　　2.檢測(cè)小鼠左室EPI心肌細(xì)胞與ENDO心肌細(xì)胞鈣瞬變動(dòng)力學(xué)變化
　　2.1.首先我們分析了鈣瞬變的幅度。Fluo-4或者Fura-2兩種熒光染料測(cè)量的結(jié)果均顯示，EPI心肌細(xì)胞的鈣瞬變幅度顯著性的小于ENDO心肌細(xì)胞，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.2.通過對(duì)心肌細(xì)胞鈣瞬變的下降進(jìn)行雙指數(shù)曲線擬合，我們分析了鈣離子濃度下降的時(shí)間常數(shù)并對(duì)EPI心肌細(xì)胞與ENDO心肌細(xì)胞進(jìn)行了比較。小鼠左室 E

9、PI心肌細(xì)胞鈣離子濃度下降的時(shí)間常數(shù)（tau）顯著性的小于ENDO心肌細(xì)胞，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，小鼠心肌左室壁EPI心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣離子泵（SERCA）活性大于ENDO心肌細(xì)胞。
　　3.FABP3對(duì)小鼠心臟左室EPI心肌組織與ENDO心肌組織及細(xì)胞的作用。我們的前期數(shù)據(jù)提示FABP3抑制心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度以及細(xì)胞收縮幅度。因此接下來我們檢測(cè)了小鼠左室收縮以及鈣調(diào)控異質(zhì)性是否與 FABP3相關(guān)。

10、
　　3.1.我們檢測(cè)了EPI心肌組織與ENDO心肌組織FABP3蛋白表達(dá)水平并對(duì)兩種數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。通過Western Blot檢測(cè)出EPI心肌組織FABP3的表達(dá)水平顯著性高于ENDO心肌組織，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，小鼠左室心肌組織存在FABP3蛋白表達(dá)水平異質(zhì)性。
　　3.2.接下來我們研究了FABP3對(duì)心肌細(xì)胞鈣火花頻率的調(diào)節(jié)。FABP3灌流組中心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣火花頻率顯著性的高于對(duì)照

11、組，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果提示，F(xiàn)ABP3導(dǎo)致了RyR2介導(dǎo)的鈣流失。
　　3.3.通過孵育鈣敏感熒光染料Fluo-4，正常臺(tái)式液灌流，觀察鈣火花。EPI心肌細(xì)胞組的鈣火花頻率顯著性的高于ENDO心肌細(xì)胞組，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，小鼠左室EPI心肌細(xì)胞舒張期肌漿網(wǎng)鈣流失情況比ENDO心肌細(xì)胞中嚴(yán)重。
　　3.4.接下來我們分別研究了FABP3在EPI心肌細(xì)胞和EN

12、DO心肌細(xì)胞中對(duì)鈣瞬變的調(diào)節(jié)作用并進(jìn)行了比較。FABP3(0.5 nmol/L)對(duì)于EPI心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度的抑制作用顯著性的強(qiáng)于其在ENDO心肌細(xì)胞中的作用，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果提示，EPI心肌細(xì)胞鈣調(diào)控對(duì)于FABP3刺激更加敏感。
　　4.MLCK3跨壁異質(zhì)性參與調(diào)節(jié)左室心肌細(xì)胞跨壁收縮梯度（Transmural contractile gradient）
　　4.1.首先我們檢測(cè)了EPI心

13、肌組織與ENDO心肌組織MLCK3蛋白表達(dá)水平并對(duì)兩種數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。在小鼠左室EPI心肌組織中MLCK3的平均蛋白表達(dá)水平顯著性高于ENDO心肌組織，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該數(shù)據(jù)提示，小鼠左室心肌組織存在MLCK3蛋白表達(dá)水平異質(zhì)性。
　　4.2.接下來我們研究了MLCK3分別在EPI心肌細(xì)胞和ENDO心肌細(xì)胞中參與收縮功能調(diào)控的程度。MLCK3的抑制劑ML-7對(duì)于EPI心肌細(xì)胞收縮幅度的抑制作用顯著性的強(qiáng)

14、于其在ENDO心肌細(xì)胞中的作用，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果提示，相對(duì)于ENDO心肌細(xì)胞， EPI心肌細(xì)胞的收縮更加依賴于MLCK3活性。
　　結(jié)論：
　　1.EPI心肌細(xì)胞的收縮能力與收縮時(shí)程顯著小于ENDO心肌細(xì)胞。
　　2.檢測(cè)小鼠左室EPI和ENDO心肌細(xì)胞鈣相關(guān)動(dòng)力學(xué)的變化
　　（1）EPI心肌細(xì)胞的鈣瞬變幅度顯著性的小于ENDO心肌細(xì)胞。
　　（2）小鼠心肌左室壁 EPI心

15、肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣離子泵活性大于ENDO心肌細(xì)胞。
　　3.FABP3對(duì)小鼠左室EPI和ENDO的影響
　?。?）小鼠左室心肌組織存在FABP3蛋白表達(dá)水平異質(zhì)性。
　?。?）小鼠左室EPI心肌細(xì)胞舒張期肌漿網(wǎng)鈣流失情況比ENDO心肌細(xì)胞中嚴(yán)重。
　?。?）EPI心肌細(xì)胞鈣調(diào)控對(duì)于FABP3刺激更加敏感。
　　4.MLCK3調(diào)節(jié)左室心肌細(xì)胞跨壁收縮梯度
　?。?）小鼠左室心肌組織存在MLCK3蛋白表達(dá)水平