鈍齒棒桿菌N-乙酰谷氨酸激酶編碼基因argB的克隆表達(dá)研究.pdf

1、L-精氨酸是人體和動(dòng)物體內(nèi)的半必需氨基酸，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝物，在醫(yī)藥工業(yè)上具有廣泛的用途，另一方面，L-精氨酸也是食品營(yíng)養(yǎng)、化妝品或特殊治療用途的重要原料。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的逐步提高，人們對(duì)健康方面給于越來(lái)越多的關(guān)注，L-精氨酸的需求量也在逐年上升。 論文以鈍齒棒桿菌CorynebacteriumcrenatumSYPA為研究菌株，依據(jù)現(xiàn)已知的C.crenatum產(chǎn)精氨酸代謝途徑利用遺

2、傳工程手段研究分析C.crenatumSYPA合成精氨酸的關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)的性質(zhì)和作用及NAGK在C.crenatumSYPA中的加強(qiáng)表達(dá)對(duì)其對(duì)產(chǎn)精氨酸的影響。 鈍齒棒桿菌C.crenatumSYPA是革蘭氏陽(yáng)性工業(yè)用菌株，其合成精氨酸的關(guān)鍵酶NAGK是由基因argB編碼，由于鈍齒棒桿菌的遺傳表達(dá)體系的研究報(bào)道甚少，本論文構(gòu)建了pET-28a-argB、pJC1-tac-argB、pC2-argB三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒

3、并成功在大腸桿菌中表達(dá)且進(jìn)行了酶的活性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-argB在大腸桿菌中表達(dá)量最高，pJC1-tac-argB次之，pC2-argB表達(dá)量最小。同時(shí)利用argB的表達(dá)載體pET-28a上含有His6-Tag組氨酸標(biāo)簽的特點(diǎn)，采用Ni-NTA柱親和層析法對(duì)目標(biāo)蛋白NAGK進(jìn)行了純化，純化獲得的重組NAGK的比酶活達(dá)0.73U/mg，純化倍數(shù)達(dá)6.61。同時(shí)對(duì)純化得到的重組NAGK酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：

4、NAGK的最適溫度為30℃，最適pH為9.0～9.5，對(duì)底物N-乙酰谷氨酸的Km值為3.35mmol/L。金屬離子Cu2+、Mn2+、螯合劑對(duì)乙酰谷氨酸激酶均有明顯的抑制作用。 本文成功將表達(dá)質(zhì)粒pJC1-tac-argB、pC2-argB通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入C.crenatumSYPA中，由于pET-28a-argB無(wú)法通過(guò)該方法轉(zhuǎn)入C.crenatumSYPA并表達(dá)且pC2-argB表達(dá)量較小，因此實(shí)驗(yàn)以pJC1-tac-a

5、rgB為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)挑取了8個(gè)鈍齒棒桿菌轉(zhuǎn)化子C.C(pJC1-tac-argB)并通過(guò)搖瓶發(fā)酵挑選出精氨酸產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子C.C2，對(duì)其NAGK進(jìn)行了酶活和發(fā)酵特性做了初步分析。C.C2中NAGK的酶活為44.5mU/mg，與出發(fā)菌株C.crenatumSYPA中NAGK的酶活31.2mU/mg相比提高了約42.6％；精氨酸產(chǎn)量達(dá)35.8g/L與出發(fā)菌株C.crenatumSYPA的29.8g/L相比提高了約23.4％，但卻發(fā)現(xiàn)N