甲狀旁腺激素1-34促進(jìn)2型糖尿病并卵巢切除大鼠骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：觀察2型糖尿病并卵巢切除大鼠骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：利用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型（type2 diabetes mellitus，T2DM）,并對(duì)大鼠行雙側(cè)卵巢切除（ovariectomized，OVX），通過X線，組織形態(tài)學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和血清學(xué)評(píng)估該動(dòng)物模型股骨閉合骨折愈合過程，分析其是否出現(xiàn)骨折愈合延遲現(xiàn)象。
　　方法：<

2、br>　　1.2月齡SD雌性大鼠，共30只，根據(jù)體重隨機(jī)將大鼠分為3組（n=10）：單純股骨骨折組（fracture，F(xiàn)），卵巢切除股骨骨折組（ovariectomy fracture，OF）和2型糖尿病并卵巢切除股骨骨折組（T2DM+ovariectomy Fracture，DOF）。
　　2.所有實(shí)驗(yàn)大鼠分別在骨折造模后2周和3周實(shí)施安樂死，對(duì)大鼠右側(cè)股骨采用 X線攝像、Micro-CT分析，脫鈣后骨痂行番紅固綠染色和Casp

3、ase-3蛋白免疫組織化學(xué)分析，利用全自動(dòng)生化分析儀技術(shù)對(duì)血清中總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）和甘油三酯（triglyceride，TG）濃度進(jìn)行測定。
　　結(jié)果：
　　1.DOF組大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)3周注射STZ造模后，血糖明顯升高，血清中總膽固醇和甘油三脂濃度顯著增高，血糖明顯高于其他兩組（P<0.05）。
　　2.三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物X線攝像觀察顯示，骨折造模后2周時(shí)，F(xiàn)組和OF組骨痂面積明顯

4、大于DOF組，F(xiàn)組和OF組間無明顯差異（P<0.05）。骨折后3周時(shí)，OF組骨痂面積明顯大于F組和DOF組（P<0.05）。
　　3.番紅固綠染色結(jié)果顯示，骨折造模2周后，F(xiàn)組骨痂中骨組織面積比明顯高于OF組和DOF組（P<0.05），OF與DOF組間并見明顯差異；F組骨痂中軟骨面積明顯大于OF組和DOF組（P<0.05），且OF組明顯大于DOF組（P<0.05）；DOF組纖維組織面積比明顯大于OF和F組，且OF組大于F組（P<0

5、.05）。骨折造模3周后，F(xiàn)組骨痂中骨組織面積比明顯高于OF組和DOF組（P<0.05），且DOF組纖維組織面積比明顯大于OF和F組（P<0.05），且OF組大于F組（P<0.05），三組間軟骨組織面積比無明顯差異。
　　4.Mirco-CT結(jié)果顯示，骨折造模2周后，F(xiàn)組骨痂中BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于OF組和DOF組（P<0.05），OF組BMD、Conn.D明顯高于DOF組（P<0.05）；DOF組和O

6、F組TB.Sp明顯高于F（P<0.05）；骨折造模3周后，F(xiàn)組骨痂中BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于OF組和DOF組（P<0.05），OF組骨痂中BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于DOF組（P<0.05），DOF組和OF組TB.Sp明顯高于F（P<0.05）。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)三組間TB.Th未見明顯差異。
　　5.Caspase-3免疫組化結(jié)果顯示，骨折造模2周后，DOF組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著

7、高于OF組和F組（P<0.05），且OF組明顯高于F組（P<0.05）。骨折造模3周后，DOF組和OF組肥大軟骨細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于F組（P<0.05）。
　　第二部分：胰島素對(duì)2型糖尿病并卵巢切除大鼠骨折愈合作用的研究
　　目的：以 T2DM并卵巢切除大鼠骨折模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，給予胰島素治療，探討胰島素對(duì)該模型動(dòng)物骨折愈合過程的影響。
　　方法：
　　1.2月齡雌性SD大鼠20只，將實(shí)

8、驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組（n=10）：T2DM并卵巢切除大鼠骨折組（DOF）和胰島素治療組（DOFI），大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后給予胰島素（諾和靈N，精蛋白生物合成人胰島素注射液）治療，早晨皮下注射注射劑量為2-4u，傍晚皮下注射注射劑量為4-6u，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材。
　　2.所有動(dòng)物分別在骨折造模后2周和3周實(shí)施安樂死，對(duì)大鼠右側(cè)股骨利用X線攝像，形態(tài)學(xué)番紅固綠染色、Micro-CT和免疫組織化學(xué)方法對(duì)骨折部位骨痂愈合情況進(jìn)行評(píng)估。

9、>　　結(jié)果：
　　1.兩組大鼠T2DM造模后均出現(xiàn)明顯的多飲多尿多食癥狀；DOFI組大鼠在接受胰島素治療后，血糖明顯降低。
　　2.兩組組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物X線攝像觀察顯示，骨折后2周后， DOFI組骨折斷端有明顯的骨痂形成，且骨痂面積明顯大于DOF組（P<0.05）。骨折造模3周后 DOFI組大鼠股骨斷端形成堅(jiān)實(shí)致密的高密度骨影，DOF組骨折端骨性骨痂并未完全連接，X線骨痂面積測量兩組間無明顯差異。
　　3.番紅固綠染色顯示，

10、骨折造模后兩周時(shí)，DOFI組與DOF組骨痂內(nèi)骨性骨痂面積比無明顯差異，DOFI組軟骨骨痂面積比明顯大于DOF組（P<0.05）；骨折造模后3周時(shí)，DOFI組骨性骨痂面積比明顯大于DOF組（P<0.05），兩組間軟骨骨痂面積無明顯差異，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)DOF組纖維骨痂面積比均明顯大于DOFI組（P<0.05）。
　　4.Mirco-CT結(jié)果顯示，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，DOFI組骨痂中BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N均明顯高于DOF組（P<

11、0.05），DOF組TB.Sp明顯高于DOFI組（P<0.05）。DOF組與DOFI組間TB.Th未見明顯差異。
　　5.Col-X免疫組化結(jié)果顯示兩周時(shí)，兩組間無明顯差異；骨折后3周，DOFI組表達(dá)量明顯高于DOF組。
　　第三部分：PTH(1-34)聯(lián)合胰島素對(duì)2型糖尿病大鼠并卵巢切除骨折愈合作用的研究
　　目的：以 T2DM并卵巢切除大鼠骨折模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，探討PTH(1-34)聯(lián)合胰島素對(duì)2型糖尿病并卵

12、巢切除大鼠骨折愈合過程的影響。
　　方法：
　　1.8周齡雌性SD大鼠30只，隨機(jī)將動(dòng)物分為3組（n=10）：T2DM并卵巢切除大鼠骨折組（DOF）、胰島素治療組（DOFI）和PTH聯(lián)合胰島素治療組（DOFIP）。大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后給予胰島素（諾和靈N，精蛋白生物合成人胰島素注射液）治療，早晨皮下注射注射劑量為2-4u，傍晚皮下注射注射劑量為4-6u，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材。骨折造模后，間斷給予DOFIP組大鼠皮下注射PTH（s

13、igma chemical co., USA）治療，一周五天，每次注射劑量為50μg/kg，DOF組給予相同劑量PTH稀釋液注射進(jìn)行對(duì)照，每周根據(jù)動(dòng)物體重對(duì)給藥劑量進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　2.所有動(dòng)物分別在骨折造模后2周和3周取材，對(duì)大鼠右側(cè)股利用X線攝像，番紅固綠染色、Micro-CT和免疫組織化學(xué)方法對(duì)骨折部位骨痂愈合情況進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　1.三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在 T2DM造模后出現(xiàn)明顯的多飲多尿多食癥狀；給予胰島素治

14、療后，DOFI組和DOFIP組血糖明顯低于DOF組。
　　2.骨折造模2周后，X線片顯示DOFIP組和DOFI組骨折斷端有明顯的骨痂形成，DOFIP組和DOFI組骨痂面積明顯大于DOF組（P<0.05），DOFIP組和DOFI組組間無明顯差異。骨折造模3周后 DOFIP組大鼠股骨斷端形成堅(jiān)實(shí)致密的高密度骨影，DOF組骨折端骨性骨痂并未完全連接，三組間骨痂面積無明顯差異。
　　3.番紅固綠染色顯示，骨折造模后2周，DOFIP骨

15、痂內(nèi)骨性骨痂面積比明顯大于DOF組（P<0.05），DOFIP組和DOFI組軟骨骨痂面積比明顯大于DOF組（P<0.05），DOF組纖維骨痂面積明顯大于DOFI組和DOFIP組（P<0.05）。骨折造模后3周DOFIP組和DOFI組骨性骨痂面積比明顯大于DOF組（P<0.05），三組間軟骨骨痂面積比無明顯差異， DOF組纖維骨痂面積明顯大于DOFI組和DOFIP組（P<0.05），DOFI組纖維骨痂面積明顯大于DOFIP組（P<0.05

16、）。
　　4.Mirco-CT結(jié)果顯示，DOFI組和DOFIP組BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于DOF組（P<0.05），DOF組TB.Sp明顯大于DOFIP組（P<0.05），三組間TB.Th未見明顯差異。骨折造模3周后，DOFIP組BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于DOFI組（P<0.05），DOFI組BMD、BV/TV、Conn.D和TB.N明顯高于DOF組（P<0.05），DOF組 TB.

17、Sp明顯大于DOFIP組（P<0.05），骨痂內(nèi) TB.Sp在 DOF組與DOFI組之間無顯著性差異，三組間TB.Th未見明顯差異。
　　5.ALP和 OPG蛋白免疫組化結(jié)果顯示，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)， DOFIP組ALP和OPG蛋白表達(dá)量明顯高于DOF組和DOFI組（P<0.05），DOFI組ALP和OPG蛋白表達(dá)量明顯高于DOF組間（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.卵巢切除骨折組大鼠骨折愈合過程較正常大鼠明顯延遲，高脂

18、飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)T2DM大鼠造模出現(xiàn)糖尿病癥狀和血脂異常，且形態(tài)學(xué)染色和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果顯示骨折愈合過程較OF組和F組延遲，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了較為充分的研究線索。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)給予T2DM并卵巢切除大鼠胰島素治療可以在一定程度上改善該種模型的骨折愈合延遲現(xiàn)象，這一作用可能與胰島素改善骨痂內(nèi)新生骨組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，增加軟骨細(xì)胞活性作用有關(guān)。
　　3.PTH(1-34)聯(lián)合胰島素治療可在骨折愈合中期通