枸杞多糖對大鼠脊髓夾傷作用的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)的修復,是神經(jīng)科學臨床研究與基礎研究的重要課題。我們已在臨床上開展損傷早期(傷后4~14 d)髓內(nèi)清創(chuàng)減壓術的研究,獲得了滿意的效果;回到相關的基礎研究,為促進進一步功能恢復和組織保護,藥物干預SCI后繼發(fā)損傷機制的研究就尤為重要。其中,藥物干預炎癥機制,尤其是針對炎癥反應的雙刃劍式作用(加重損傷/促進修復),如巨噬細胞的M1/M2極化,是我們的重點方向。枸杞多糖(Lycium B

2、arbarum Polysaccharide,LBP),為傳統(tǒng)中藥枸杞的水溶性提取物,其已知的功能,除直接的神經(jīng)保護和抗氧化作用,還可調(diào)節(jié)免疫功能,而神經(jīng)損傷、氧化應激和免疫機制均為SCI中導致繼發(fā)損傷的重要機制。但目前針對LBP在脊髓損傷中的作用尚無直接證據(jù)。
　　脊髓損傷研究面臨的另外一個重要問題在于病理變化復雜且細微,因此,建立重復性和穩(wěn)定性好的動物模型至關重要。目前,大鼠脊髓損傷模型中以撞擊傷和擠壓傷模型最為常用。雖然兩者

3、都可很好地模擬臨床脊髓損傷的病理過程,但它們都存在自損傷部位起,沿脊髓長軸向髓內(nèi)遠端分布的出血,該成分隨病程進行性變化,且范圍和程度難以控制,是建立穩(wěn)定模型所必須解決的問題。
　　對于上述髓內(nèi)損傷遠端出血的成因,目前尚無合理統(tǒng)一的解釋。因此本研究的第一部分在大鼠脊髓擠壓損傷模型對此進行了探討。
　　針對脊髓撞擊傷和擠壓傷模型存在的問題,本研究的第二部分根據(jù)前一部分結果,針對一種脊髓夾傷模型進行改良,最大限度降低遠端出血的干擾

4、,獲得病理過程相對穩(wěn)定的大鼠脊髓損傷模型,為后續(xù)實驗奠定了基礎。
　　在模型研究基礎上,本研究的第三部分針對LBP在大鼠脊髓損傷的治療作用展開研究,尤其關注了LBP對SCI后的免疫調(diào)節(jié)和組織保護的作用機制。
　　第一部分:脊髓擠壓損傷中髓內(nèi)遠端出血的成因。
　　脊髓擠壓損傷模型是以重物緩慢壓迫脊髓,造脊髓腹背向完全受壓。
　　經(jīng)組織學觀察:傷后6 h和3 d,在脊髓損傷位置以遠可見明顯出血,其具體位于后索內(nèi)皮質(zhì)脊

5、髓束與其背側(cè)白質(zhì)之間。
　　我們于損傷即刻,在損傷區(qū)域吻尾端切斷脊髓后索,結果表明,至傷后3 d,遠端出血未出現(xiàn);于損傷即刻在損傷中心注射碳粉,結果示,在傷后6 h遠端出血內(nèi)可見碳粉存在。
　　該結果提示,遠端出血來源于損傷中心出血的直接擴散,而不是形成于遠處血管結構的直接受損;其分布特征的形成,可能與后索內(nèi)皮質(zhì)脊髓束及其背側(cè)白質(zhì)有關。所以,避免該遠擴出血關鍵可能在于控制損傷區(qū)的出血程度。
　　第二部分:在夾傷模型避免

6、遠擴出血,獲得一種穩(wěn)定的大鼠脊髓損傷模型。
　　鑒于第一部分的結果,為避免遠擴出血,我們采用鑷子從兩側(cè)夾傷脊髓造模,選擇該模型是因為:1)便于調(diào)整擠壓程度,即通過設置最終脊髓夾傷狀態(tài)時鑷子兩刃保留的間距來調(diào)節(jié)夾傷程度;2)擠壓力從兩側(cè)向內(nèi)作用到脊髓,減輕牽扯后索內(nèi)的皮質(zhì)脊髓束。
　　我們造不同程度的脊髓夾傷,即設置鑷子在脊髓夾傷狀態(tài)下最終保留的間距分別為0.2,0.5或0.8 mm,比較損傷即刻出血范圍:在0.5 mm的損傷

7、,損傷中心主要為一梭形出血灶,無遠擴出血,損傷結果穩(wěn)定,個體差異小(變異率10.4％);其他損傷程度,過重(鑷子間距0.2 mm)可致遠擴出血,過輕(鑷子間距0.8 mm)可間接增強系統(tǒng)誤差的影響,個體間差異均較大(變異率:0.2 mm,22%;0.8 mm,55%)。
　　在上述0.5 mm的夾傷中,出血主要分布脊髓灰質(zhì)內(nèi),所以兩側(cè)灰質(zhì)內(nèi)出血占總出血絕大部,中央管附近灰質(zhì)內(nèi)出血占小部。我們在不同矢狀切面分別統(tǒng)計出血范圍并統(tǒng)計動物

8、間個體差異,其中,在包含了一側(cè)灰質(zhì)主要部分的切面內(nèi)的出血范圍,其個體差異(變異率8%)明顯低于中央管附近切面(變異率17%)。
　　在傷后7 d,0.5 mm損傷仍造成穩(wěn)定的繼發(fā)損傷,包括損傷范圍(變異率9.9%)、損傷旁區(qū)殘留神經(jīng)元數(shù)量(變異率10.2%)、少突細胞凋亡數(shù)量(變異率13.5%)、巨噬/小膠質(zhì)細胞活化(變異率11%)。
　　所以,0.5 mm的夾傷可避免遠擴出血,所致原發(fā)損傷個體差異小,為一種穩(wěn)定的脊髓損傷模

9、型。其中,兩側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的損傷結果尤為穩(wěn)定,可作為良好的觀察對象。
　　第三部分:LBP對大鼠脊髓夾傷的作用
　　方法:
　　動物實驗在上述大鼠脊髓夾傷模型開展(鑷子間距0.5 mm)。
　　LBP給藥方案有兩種,分別針對各自目的:LBP-pre,因LBP起效慢,且已有LBP的動物實驗都在疾病模型建立前數(shù)天即開始給藥,所以,為保證損傷即刻LBP即開始起效和便于與以往的LBP研究結果比較,我們從損傷前第7 d開始給藥,

10、至處死動物取材;LBP-aft,在脊髓損傷后7 d開始給藥至實驗結束,該部實驗視LBP為SCI后的一項治療性干預進行研究。對照組分別在同時刻給雙蒸水,所有藥物經(jīng)胃給予。
　　在LBP-pre組的傷后7 d和14 d以及LBP-aft組的傷后14 d,Western Blotting(WB)檢測ED1,iNOS(M1型極化巨噬/小膠質(zhì)細胞標志)和Arg1(M2型極化巨噬/小膠質(zhì)細胞標志);形態(tài)學檢測包括:損傷區(qū)面積(以GFAP強陽性

11、標記為邊緣),在損傷旁區(qū)(GFAP邊緣以外一定范圍內(nèi))比較GFAP和ED1(人CD68的大鼠同型物,活化巨噬/小膠質(zhì)細胞標志)免疫熒光強度,并計數(shù)ED1+iNOS+(M1型極化巨噬/小膠質(zhì)細胞)和ED1+Arg1+(M2型極化巨噬/小膠質(zhì)細胞)細胞;
　　細胞培養(yǎng)是為進一步驗證在體實驗中關于膠質(zhì)瘢痕和巨噬/小膠質(zhì)細胞的結果,包括大鼠原代星形膠質(zhì)細胞和N9小膠質(zhì)細胞系的培養(yǎng)。
　　原代星形膠質(zhì)細胞,給予處理:LBP v.s.空

12、白對照;LBP聯(lián)合TNFα+IFNγ+LPS v.s. TNFα+IFNγ+LPS。在免疫細胞染色檢測熒光強度,結合WB,比較GFAP表達差異。其中,已知TNFα+IFNγ+LPS可刺激星形膠質(zhì)細胞活化。
　　N9細胞大體包括2部分實驗:
　　1)為明確LBP以及LBP聯(lián)合LPS+IFNγ(刺激巨噬細胞M1極化)或IL-4(刺激巨噬細胞M2極化)對N9細胞極化的影響,分別一次性給予以下處理:LBP v.s.空白對照;LBP聯(lián)

13、合LPS+IFNγv.s. LPS+IFNγ;LBP聯(lián)合IL-4 v.s. IL-4。
　　2)為在N9細胞模擬動物實驗中LBP-pre和LBP-aft,接連給予N9細胞兩種不同的刺激,每種刺激持續(xù)1 d?！癓BP-pre”:1st d,LBP,2nd d,LBP聯(lián)合LPS+IFNγ+IL-4;對照組每天給予無LBP的相同刺激?！癓BP-aft”:1st d,LPS+IFNγ+IL-4,2nd d,LBP聯(lián)合LPS+IFNγ+IL

14、-4;對照組每天給予無LBP的相同刺激。WB檢測iNOS和Arg1水平。
　　結果:
　　損傷區(qū)范圍的結果出乎我們意料:LBP-pre組在7 d和14 d均較其對照組損傷面積擴大(7 d:1.30 v.s.0.97,14 d:1.17 v.s.0.75 mm2);LBP-aft則相反,傷后14 d損傷面積較對照縮小(0.56 v.s.0.80 mm2)。
　　為解釋上述LBP對損傷組織損傷的相反影響,開展以下實驗:

15、r>　　星形膠質(zhì)細胞為膠質(zhì)瘢痕主要成分,直接影響損傷區(qū)變化,原代星形膠質(zhì)細胞和在體結果示,各種給藥方式下的LBP對GFAP表達均沒有影響。
　　ED1是巨噬/小膠質(zhì)細胞活化的標志之一。LBP-pre較對照組,在7 d和14 d,ED1熒光強度均增加,且該熒光強度增加與損傷范圍擴大成正相關,WB亦示,LBP-pre動物ED1表達水平在7 d和14 d均高于對照組;但LBP-aft動物較對照組,在傷后14 d的ED1熒光強度和WB均未

16、見差別。
　　ED1結果仍不能完全解釋損傷范圍的變化,于是我們轉(zhuǎn)向巨噬/小膠質(zhì)細胞的M1/M2極化(iNOS/Arg1)。
　　iNOS和Arg1:
　　動物實驗,WB結果示:LBP-pre較對照組,在7 d和14 d,均上調(diào)iNOS,下調(diào)Arg1, iNOS/Arg1比值增加;LBP-aft較對照組,在14 d,iNOS和 Arg1均增加,但后者增加的幅度更大,所以iNOS/Arg1比值減小。因iNOS也可表達于中性

17、粒細胞、神經(jīng)元等,我們行免疫熒光染色以明確iNOS/Arg1比值是否反應M1/M2變化:損傷旁區(qū)內(nèi)iNOS和Arg1主要表達在ED1+細胞,LBP-pre的給藥組較對照ED1表達上調(diào),M1細胞增多, M2細胞減少,M1/M2比例上調(diào)。LBP-aft的治療組較對照M1無明顯差異,M2細胞增多,M1/M2比例下降。
　　在N9,LBP或LBP聯(lián)合IL-4均較各自對照組,iNOS水平提高,Arg1下降,雖然LBP聯(lián)合LPS+IFNγ與其

18、對照間未見差別。在模擬在體LBP-pre和LBP-aft給藥方案的N9細胞實驗,“LBP-pre”較對照組,仍為iNOS上調(diào),Arg1下調(diào);但“LBP-aft”較對照組,反而iNOS下降,Arg1增加。
　　綜上,LBP-pre和LBP-aft分別加重組織受損和促進組織修復。鑒于SCI中M1極化加重組織受損,M2極化促進組織修復,M1/M2比值則決定巨噬/小膠質(zhì)細胞的“好壞”,所以兩種給藥方式下LBP對巨噬細胞極化的影響差別可能解