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![生長因子受體結合蛋白10對Bim介導的細胞凋亡影響的研究.pdf_第1頁](/static/common/images/lazy-load.png)
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文檔簡介
1、在多細胞生物中,凋亡是一種正常的生理過程,該過程清除了多余的細胞,確保了胚胎發(fā)育和組織分化的完成,維持了體內細胞數量的動態(tài)平衡。細胞內線粒體凋亡途徑是凋亡的主要途徑之一。線粒體途徑是由促凋亡和抗凋亡Bcl-2蛋白家族蛋白調控。Bim屬于BH3-only促凋亡蛋白,其首先被發(fā)現(xiàn)于和Bcl-2結合的蛋白中。到目前為止,至少有11種Bim的異構體被報道。Bim EL、Bim L和Bim S可以與位于線粒體外膜的Bcl-2及Bcl-XL結合,從
2、而激發(fā)了細胞色素C的釋放,進而引起細胞凋亡。Bim EL和Bim L可以與動力馬達蛋白復合體的動力蛋白輕鏈LC18結合,這種結合抑制了它們的促凋亡活性。當外界應激激活JNK途徑時,結合于細胞骨架上的Bim被磷酸化并從骨架上脫落激活。Bim S缺少可與動力蛋白結合的結構域而具有更潛在的細胞毒性。已經證實的能夠結合于Bim啟動子上的轉錄因子有FoxO3 (FKHRL1)、Myb和RUNX3。當外界刺激能夠激活Rb時,其下游的E2F則結合于B
3、im的啟動子,同樣啟動其轉錄。TGF-β能通過Smad3來上調Bim的表達,同時TGF-β還能導致RUNX3結合于Bim的啟動子來上調Bim的轉錄。對Bim的翻譯后調控主要集中在JNK對Bim的磷酸化。此外Mcl-1與Bim的相互作用也能阻止Bim的誘凋亡作用。最近研究表明Bim還可通過蛋白質降解途徑得到控制。通過被活化的ERK1/2磷酸化Bim EL的絲氨酸而導致Bim被蛋白酶體降解。 我們的實驗以pLexA-Bim L為ba
4、it,用酵母雙雜交的方法對胎腦pB42AD文庫進行篩選以找出與Bim L相互作用的蛋白。在11個重復2次或2次以上的陽性克隆中,我們重點對生長因子受體結合蛋白10(Grb10)進行了深入研究。通過生物信息學分析和多組織RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在16種成人正常組織中,Grb10是廣泛表達的,尤其是在胰島素靶組織如:胰腺和骨骼肌中表達量最高,提示其在胰島素信號通路中起一定作用。在Bim L和Grb10的亞細胞共定位實驗中,我們發(fā)現(xiàn)過量表達的B
5、im L在短時間內以點狀分布于胞質中,一定時間后會擴散至整個細胞。而Grb10主要集中在細胞核周圍,與線粒體的分布相似。但通過線粒體特異性染料Mito-tracker對線粒體進行染色后,我們發(fā)現(xiàn)Grb10和線粒體部分重疊,提示在過量表達情況下,Grb10很可能位于線粒體及其周圍質膜以及胞質中。而GFP-Bim L與Grb10-RFP有部分重疊,說明在空間上兩者也有相互作用的可能。利用免疫共沉淀實驗,我們確定了Bim L能與Grb10結合
6、,提示了Grb10在Bim L參與的凋亡途徑中可能有一定的作用。細胞凋亡實驗結果表明,在Grb10過量表達的情況下,由Bim L介導的細胞凋亡會在一定程度上得到抑制。因為Grb10中的SH2結構域可以與磷酸化的酪氨酸受體特異性結合,我們根據Bim L蛋白序列中可能進行磷酸化的酪氨酸位點進行了定點突變。但細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn),發(fā)生酪氨酸點突變的Bim L所誘導的凋亡被Grb10抑制的效果沒有受到明顯影響,說明Grb10與Bim L的結合可能通
7、過其它方式和/或部位進行。為進一步尋找Grb10與Bim L的相互作用區(qū)域,我們對Grb10對Bim L的不同異構體Bim S、Bim α 2及Bimα 3誘凋亡的抑制作用進行了比較,發(fā)現(xiàn)Grb10對Bim S和Bim α 3無明顯抑制效果,對Bim α 2有一定抑制作用。根據Bim L及其異構體的結構域組成特點,實驗結果提示Grb10可能是通過DBD結構域與Bim L結合。在磷酸化位點預測中,Bim L蛋白的Ser44和Thr56絲氨
8、酸和位于該結構域中,我們分別檢測了Grb10對Ser44和Thr56點突變Bim L的抑制作用,結果無明顯抑制,實驗結果提示Grb10與Bim的相互作用與這兩個位點可能有關。但由于這兩個位點可能與ERK1/2和 JNK的磷酸化有關,還需進行更深入研究來闡明這兩個位點在Grb10與Bim L的結合中的角色。此外,為進一步尋找Grb10在胰島素受體和生長因子受體途徑之外的重要靶標和配體,我們以pLexA- Grb10為bait,用酵母雙雜交
9、的方法對胎腦pB4-2AD文庫進行篩選,我們發(fā)現(xiàn)與Grb10可能有相互作用的蛋白在細胞中的作用基本上都與促進細胞增殖或阻止細胞凋亡有關。TCTP可調節(jié)Tsc- Rheb信號途徑,促進細胞增殖和防止凋亡;PSMA 可協(xié)助磷酸化的Bim降解;ProT α阻止凋亡體的形成,負向調控caspase-9的活性,從而抑制細胞凋亡產生癌變。 Grb10與Bim L具有相互作用提示Grb10除了在胰島素受體途徑中的作用還參與由Bim介導的細胞凋
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