成纖維生長因子21和AdipoRon調(diào)控脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝的機(jī)理研究.pdf

1、豬肉是我國人民主要消費(fèi)的肉食品，然而隨著生活水平的提高，人們已經(jīng)不滿足于溫飽，而是更傾向于高品質(zhì)肉類的消費(fèi)，對肉類的口感等提出了更高的要求?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為尋找提高肌肉品質(zhì)的重要基因或能夠改善肉質(zhì)的靶標(biāo)提供了有力支持。
　　成纖維生長因子21(FGF21)是一種肽類激素，由多個器官合成并參與調(diào)節(jié)能量代謝。令人興奮的是眾多研究表明FGF21具有對代謝有益的作用，這包括降低體重和改善血糖。在肝臟中，F(xiàn)GF21對調(diào)節(jié)禁食、高脂飼喂?fàn)?/p>

2、態(tài)下脂肪酸氧化發(fā)揮很重要的作用。在白色脂肪組織中，F(xiàn)GF21參與糖代謝，并促進(jìn)白色脂肪組織的棕色化。但是關(guān)于FGF21對豬肉的肌內(nèi)脂肪的影響，以及對提高肌內(nèi)脂肪含量的飼料添加劑的研究卻鮮有報道。AdipoRon是一種脂聯(lián)素受體激動劑，參與機(jī)體脂質(zhì)代謝和能量代謝，提高機(jī)體胰島素敏感性，是治療胰島素抵抗相關(guān)疾病的一個候選藥物。本文重點(diǎn)研究了FGF21和小分子合成藥物AdipoRon對豬和小鼠模型中脂代謝的調(diào)控，主要結(jié)果如下:
　　1.

3、為了了解FGF21對肌內(nèi)脂肪沉積的作用，我們利用“差速貼壁法”成功分離了豬原代肌內(nèi)脂肪（intramucular fat，IMF）細(xì)胞，該細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，與成纖維細(xì)胞形狀類似。細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的脂肪滴。
　　2.向生長狀態(tài)良好，并達(dá)到80％匯合的IMF細(xì)胞完全培養(yǎng)基中加入IBMX、DEX和胰島素，處理8天后前體脂肪細(xì)胞將逐步分化為成熟脂肪細(xì)胞。油紅O染色結(jié)果顯示大量細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，并在油紅O的作用下呈現(xiàn)橘紅色，說

4、明IMF細(xì)胞已成功分離。
　　3.對原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞實施穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選，逐步出現(xiàn)了FGF21穩(wěn)定單克隆(FM)，實時定量PCR結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞FGF21的mRNA水平顯著高于對照組，并且Western blot也表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中FGF21的蛋白水平顯著提高。
　　4.通過對兩組分化處理后的細(xì)胞進(jìn)行成脂分化處理，并對分化八天的細(xì)胞做油紅O染色。染色結(jié)果顯示經(jīng)過八天分化后對照組細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)

5、大量細(xì)小的脂肪滴，然而FM組細(xì)胞中脂肪滴明顯比對照組少。
　　5.為了研究成脂分化相關(guān)基因在FM組和對照組之間的表達(dá)差異，我們制備了這兩個組的cDNA文庫和細(xì)胞總蛋白。實時定量PCR結(jié)果顯示表達(dá)PPARγ基因的mRNA水平顯著低于對照組，并且對PPARγ表達(dá)起到關(guān)鍵作用的CEBPα和CEBPδmRNA水平顯著低于對照組;同時我們還檢測到了PPARγ和CEBPα的蛋白表達(dá)量顯著低于對照組。CEBPδ的mRNA水平并無差異，但是蛋白表

6、達(dá)量明顯低于對照組。同時參與PPARG mRNA表達(dá)的KLF2、SIRT1、SIRT2和FOXO1基因的mRNA水平無明顯差異，調(diào)控CEBPα表達(dá)的COUP-TFⅡmRNA無明顯變化。然而實驗組中KLF3的mRNA水平顯著高于對照組，而KLF5的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組。FAS和HSL之間的比值下調(diào)了，但未達(dá)到顯著水平，并且AGPAT和visfatin表達(dá)無差異。
　　6.FABP4和PLIN1的mRNA表達(dá)在FGF21超表

7、達(dá)組顯著降低，但是并沒有檢測到GLUT4和ADIPOQ mRNA的改變。Western Blot的結(jié)果證實了FABP4和ADIPOQ的蛋白顯著降低。然而FGF21對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路無顯著影響。而且FGF21也沒有改變CEBPα啟動子靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域(-172-+2bp)的甲基化水平（FM:control=1.1％:1.5％）。但是我們發(fā)現(xiàn)成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CEBPβ通過結(jié)合到FGF21啟動子區(qū)域，抑制FGF2

8、1基因的轉(zhuǎn)錄。
　　7.與此同時，我們應(yīng)用小鼠模型進(jìn)一步研究脂聯(lián)素受體激動劑模擬物AdipoRon如何參與PPARα信號進(jìn)而調(diào)控FGF21提高機(jī)體胰島素敏感性。數(shù)據(jù)表明低脂飼料飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon藥物處理10天后，體內(nèi)脂肪的總體含量沒有變化，并且脂肪分解蛋白表達(dá)無差異。然而高脂飼料飼喂的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon藥物處理10天后，白色脂肪組織中脂肪分解

9、相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制，降低了血液中棕櫚酸和甘油的周轉(zhuǎn)速率。同時由于肝臟中來自脂肪酸β氧化的乙酰輔酶A含量的減少，降低了對丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的激活作用，從而減少內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)量。
　　8.通過提取兩組肝臟組織總蛋白，運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測蛋白表達(dá)水平，數(shù)據(jù)顯示AdipoRon激活了肝臟內(nèi)PPARα信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肝臟內(nèi)FGF21的表達(dá)與分泌，上調(diào)血液濃度中FGF21濃度