冠心病患者血漿高密度脂蛋白組分功能與機(jī)體炎癥狀態(tài)的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分:冠心病患者血漿高密度脂蛋白組分與血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性研究研究背景:
　　炎癥是促進(jìn)冠心病(coronary artery disease，CAD)發(fā)生、發(fā)展的重要因素。已有研究表明血漿炎癥指標(biāo)與CAD的關(guān)系密切，尤其是在急性冠脈病變患者中，血漿中某些急性時相反應(yīng)蛋白和炎癥因子的水平升高意味著預(yù)后不良。然而，這些炎癥相關(guān)指標(biāo)與穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD)之間的關(guān)

2、聯(lián)研究甚少。而炎癥促進(jìn)CAD的具體機(jī)制尚不明確。血漿高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）可通過促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流、抗炎癥及抗氧化反應(yīng)，以及直接的內(nèi)皮保護(hù)功能抑制動脈粥樣硬化。血漿高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平過低是心血管疾病發(fā)生的獨立危險因素。然而，最近發(fā)現(xiàn)高血漿HDL-C水平者仍然存在發(fā)生急性心肌梗死的風(fēng)險，CA

3、D患者血漿HDL-C水平預(yù)測心臟事件的能力下降，有可能與CAD患者血漿HDL的保護(hù)功能減弱或喪失有關(guān)。越來越多的研究證實炎癥是引起血漿HDL功能及組分改變的重要因素之一，而CAD患者體內(nèi)長期存在的慢性炎癥有可能通過干擾HDL代謝引起HDL-C水平及HDL組分的改變，進(jìn)而影響了HDL正常生理功能的發(fā)揮。血清淀粉樣蛋白（serum amyloid A，SAA）是一種由肝臟合成的急性時相反應(yīng)蛋白，炎癥反應(yīng)時，血漿SAA水平升高，且可摻入HDL

4、顆粒中，影響HDL的功能。本課題組的前期研究已發(fā)現(xiàn)，CAD患者血漿HDL中的SAA水平升高。因此，為了進(jìn)一步研究CAD患者體內(nèi)炎癥狀態(tài)與HDL組分中SAA（HDL-associated SAA）水平的關(guān)系以及炎癥相關(guān)指標(biāo)在CAD診斷中是否具有價值，本研究擬從以下研究目的入手，進(jìn)行研究。
　　研究目的:
　　1.比較穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD)患者、急性冠脈綜合征(ac

5、ute coronary syndrome，ACS)患者與非CAD對照者之間血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)[急性時相反應(yīng)蛋白hsCRP（高敏C反應(yīng)蛋白）、AAT（α1-抗胰蛋白酶）和SAA/炎癥因子IL-6（白細(xì)胞介素-6）和MCP-1（單核細(xì)胞趨化蛋白-1）]水平的差異。
　　2.評價單獨或聯(lián)合檢測上述血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)在CAD診斷中的價值。
　　3.分析比較CAD患者（包括sCAD及ACS患者）血漿HDL-C水平、HDL-associa

6、tedSAA水平與上述血漿急性時相反應(yīng)蛋白/炎癥因子水平之間的相關(guān)性。
　　研究方法:
　　1.臨床病例收集:本研究共納入經(jīng)冠狀動脈造影確診的CAD患者116例及性別、年齡相匹配的非CAD對照患者65例。根據(jù)患者胸痛發(fā)作的特點及心肌酶學(xué)等檢查結(jié)果，將CAD組進(jìn)一步分為穩(wěn)定性冠心病(stable coronary artery disease，sCAD，n=42)及急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome

7、，ACS，n=74)兩亞組。
　　2.實驗室指標(biāo)檢測:所有研究對象采集空腹靜脈血，超速密度梯度離心法分離提取血漿HDL。采用BCA法檢測血漿HDL樣品中的蛋白含量，免疫印跡法鑒定HDL樣品中載脂蛋白A-Ⅰ的富集。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)技術(shù)檢測血漿α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)水平、血漿SAA水平以及HDL組分相關(guān)的SAA水平。液

8、相芯片技術(shù)檢測血漿白細(xì)胞介素-6（interleukine-6，IL-6）及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotactic protein1，MCP-1)的水平。
　　3.數(shù)據(jù)分析:統(tǒng)計學(xué)方法比較各組間上述急性時相反應(yīng)蛋白/炎癥因子血漿水平的差異。Logistic回歸分析上述炎癥指標(biāo)與CAD發(fā)病之間的關(guān)系。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價上述指標(biāo)單獨

9、或聯(lián)合檢測在診斷CAD方面的價值。非參數(shù)Z檢驗比較不同指標(biāo)在CAD診斷中的價值差異。Pearson或Sperman相關(guān)性分析評價血漿HDL-C水平、HDL-associated SAA水平與上述急性時相反應(yīng)蛋白/炎癥因子血漿水平的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1.與非CAD對照組相比較，ACS患者血漿hsCRP、AAT、SAA、IL-6以及MCP-1的水平均明顯升高[hsCRP:2.59(1.07-5.31) mg/L vs

10、.1.21（0.70-2.07）mg/L，P＜0.001; AAT:151.55±22.17 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl,P=0.005; SAA:9.54(2.92-24.50)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml, P＜0.001; IL-6:2.37(1.57-6.30) pg/ml vs.1.77(1.175-2.62) pg/ml, P＜0.001;MCP-1:305.26(2

11、44.96-373.29) pg/ml vs.281.29(225.74-344.01) pg/ml,P=0.013]。而在sCAD患者中，除血漿MCP-1水平外[264.15(215.35-391.30) pg/ml vs.281.29(225.74-344.01) pg/ml，P=0.213]，hsCRP、AAT、SAA及IL-6的血漿水平均高于非CAD對照組[hsCRP:2.20(1.27-3.45)mg/L vs.1.21(0.

12、70-2.07)mg/L，P=0.001;AAT:148.90±26.36 mg/dl vs.137.35±12.67 mg/dl,P=0.047;SAA:7.04(4.26-15.63)μg/ml vs.4.99(2.53-9.88)μg/ml,P=0.004; IL-6:2.46(1.66-4.01)pg/ml vs.1.77(1.175-2.62) pg/ml，P=0.026]。上述各炎癥指標(biāo)在ACS患者與sCAD患者之間的差異均

13、未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　2.多因素Logistic回歸分析顯示:在校正了其他傳統(tǒng)的心血管危險因素后，血漿IL-6水平與SAA水平仍與CAD相關(guān)(IL-6:0R=5.384，95％CI:1.194-24.283，P=0.029; SAA:0R=5.205,95％CI:1.326-20.423,P=0.018)。
　　3.CAD患者血漿hsCRP、SAA以及IL-6水平與冠狀動脈狹窄程度相關(guān)(hsCRP:r=0

14、.274,P=0.004;SAA: r=0.215,P=0.025; IL-6: r=0.210,P=0.027)。
　　4.聯(lián)合上述指標(biāo)可提高CAD的診斷價值，ROC曲線下面積AUC=0.849，95％CI:0.776-0.906，顯著高于各指標(biāo)單獨檢測（P均＜0.05），敏感度為63.3％，特異度為88.2％。
　　5.相關(guān)性分析顯示:血漿HDL-C水平與hsCRP水平的相關(guān)性僅存在于總研究人群中（r=-0.192，P=

15、0.011）。CAD患者中血漿HDL-C與hsCRP水平之間無顯著相關(guān)性（r=-0.132，P=0.165），而HDL-associated SAA水平則與上述各炎癥指標(biāo)均具有顯著的相關(guān)性（hsCRP: r=0.584，P＜0.001; AAT:r=0.221，P＜0.001:SAA:r=0.740,P＜0.001; IL-6:r=0.412,P＜0.001; MCP-1: r=-0.242,P=0.009）。
　　研究結(jié)論:

16、r>　　1.CAD患者體內(nèi)存在慢性炎癥反應(yīng)。無論sCAD或ACS患者血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)（hsCRP、AAT、SAA、IL-6和MCP-1）水平均顯著升高。
　　2.高血漿IL-6和SAA水平可能增加冠心病的發(fā)生風(fēng)險。
　　3.應(yīng)用上述炎癥相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高CAD的診斷能力。
　　4.血漿炎癥指標(biāo)與HDL-associated SAA水平具有相關(guān)性，而HDL-C僅與hsCRP水平呈弱的負(fù)相關(guān)性。提示:HDL組分相關(guān)蛋白

17、可能是與疾病狀態(tài)關(guān)系更為密切的指標(biāo)，可能成為CAD的診治靶點。
　　第二部分:冠心病患者血漿HDL促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的機(jī)制研究研究背景:
　　一直以來，血漿高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)被認(rèn)為具有心血管保護(hù)功能。健康人血漿HDL能夠顯著抑制多種致動脈粥樣硬化性物質(zhì)所引起的血管內(nèi)皮損傷。HDL生理功能的發(fā)揮依賴于其組成成分及含量的正常。然而，最近證實:在某些疾病時，血漿HDL存在

18、不同程度的功能障礙。其中，炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致HDL組分及其功能改變的重要因素之一。冠心病(coronary artery disease,CAD)是一種血管壁的慢性炎癥性疾病，已有研究報道CAD患者血漿HDL的內(nèi)皮保護(hù)功能受損，但具體機(jī)制尚不清楚，推測CAD患者體內(nèi)長期存在的慢性炎癥反應(yīng)促使血漿HDL組分改變可能是部分原因。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）是肝臟合成的一種急性時相反應(yīng)蛋白，本課題組前期工作及國內(nèi)

19、外其他研究小組均已證實CAD患者血漿HDL組分中SAA的含量顯著增加。富集了SAA的血漿HDL其抗炎能力減弱，但具體機(jī)制尚不清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為局部炎癥反應(yīng)的主動參與者，CAD患者的血漿HDL有可能促進(jìn)其炎癥激活。因此，本部分研究擬從CAD患者的HDL是否能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子入手，探討其對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.觀察比較CAD患者與非CAD對照組血漿HDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的影

20、響。
　　2.研究CAD患者血漿HDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活的信號通路。
　　3.探索SAA富集在CAD患者血漿HDL促炎性功能轉(zhuǎn)變中的作用。研究方法:
　　本研究納入經(jīng)冠狀動脈造影確診的CAD患者12例，以及性別、年齡相匹配的非CAD對照者10例。所有研究對象留取空腹靜脈血，應(yīng)用密度梯度超速離心法分離提取血漿HDL，即為HDLCAD和HDLcontrol。將對照組血漿與重組人SAA于體外條件下共同孵育，分離提取血漿H

21、DL，即為富含SAA的HDL（HDL-bound-SAA）。分別以濃度為100μg/ml的HDLCAD、HDLcontrol與HDL-bound-SAA處理體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，觀察不同干預(yù)對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活狀態(tài)的影響。以下述指標(biāo)判斷內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥激活狀態(tài):(1)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB) p65亞基的入核情況;(2

22、)Realtime-PCR及ELISA方法檢測白細(xì)胞介素-6（interleukine-6，IL-6）及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達(dá)與分泌情況;(3) Realtime-PCR及Western blot法檢測細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及Toll樣受體2（Toll-like receptor

23、2，TLR2）的表達(dá)。為探索HDLCAD刺激內(nèi)皮細(xì)胞引發(fā)炎癥的可能機(jī)制，分別以TLR2中和抗體阻斷內(nèi)皮細(xì)胞TLR2介導(dǎo)的信號通路，以p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑SB203580阻斷該通路的作用，確定富含SAA的HDLCAD誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的信號通路。
　　研究結(jié)果:
　　1.與HDLcontrol不同，HDLCAD本身可刺激內(nèi)皮細(xì)胞NF-κBp65亞基向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1的合成分泌

24、以及ICAM-1的表達(dá)。
　　2.TLR2中和抗體與p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑SB203580均可顯著抑制HDLCAD所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表達(dá)，說明HDLCAD刺激內(nèi)皮細(xì)胞炎癥指標(biāo)升高是通過TLR2及p38MAPK信號通路激活的。
　　3.與HDLcontrol相比，HDL-bound-SAA可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1的合成分泌以及ICAM-1的表達(dá)，與HDL