肝纖維化大鼠肝組織及血液微環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的:
　　本課題組的前期研究證明肝功正常的大鼠肝組織勻漿上清液可誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，HUCMSCs)定向分化為具有部分肝細(xì)胞功能的肝樣細(xì)胞，考慮到干細(xì)胞在移植后可隨血液循環(huán)“歸巢”于損傷靶器官的特點(diǎn)，我們推測纖維化肝組織微環(huán)境也許更有利于干細(xì)胞向肝細(xì)胞的定向分化。本研究擬采用大鼠纖維化肝組織勻漿上清液體外模擬纖維化肝組織微環(huán)境對HUCMS

2、Cs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從細(xì)胞形態(tài)、肝細(xì)胞表面標(biāo)志物、肝細(xì)胞功能等方面評價其在特定微環(huán)境下的分化潛能，并進(jìn)一步平行比較纖維化肝組織微環(huán)境與正常肝組織微環(huán)境及肝纖維化大鼠血液微環(huán)境與正常大鼠血液微環(huán)境誘導(dǎo)HUCMSCs向肝細(xì)胞分化的效果，旨在為干細(xì)胞移植治療肝纖維化提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.大鼠纖維化肝組織微環(huán)境誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究采用腹腔注射3％硫代乙酰胺生理鹽水溶液(200mg/kg，

3、2次/周，共4周)的方法制備SD(Sprague Dawley)大鼠肝纖維化模型，取造模成功的大鼠肝臟制備肝組織勻漿上清液。取第三代HUCMSCs進(jìn)行分組培養(yǎng):①對照組:含10％胎牛血清(FetalBovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基;②纖維化肝組織勻漿組:含10％FBS及50g/L纖維化肝組織勻漿上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基。誘導(dǎo)開始后于倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;取對照組及誘導(dǎo)7d的纖維化肝組織勻漿

4、組細(xì)胞，采用Western Blot法檢測細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin18，CK18)、甲胎蛋白(AlphaFetoprotein，AFP)、CYP3A4的表達(dá)情況，采用過碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff，PAS)染色檢測細(xì)胞儲存糖原的能力，分別采用二乙酰肟比色法及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)法測定兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中尿素(Blood Urea

5、 Nitrogen，BUN)及白蛋白(Albumin，ALB)的含量。
　　2.纖維化肝組織微環(huán)境與正常肝組織微環(huán)境誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化效果的比較研究
　　將第三代HUCMSCs進(jìn)行分組培養(yǎng):①對照組:含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基;②纖維化肝組織勻漿組:含10％FBS及50g/L纖維化肝組織勻漿上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基。③正常肝組織勻漿組:含10％FBS及100g/L正常肝組織勻漿上清液的DME

6、M/F12培養(yǎng)基。誘導(dǎo)開始后于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;取對照組及誘導(dǎo)7d的勻漿組細(xì)胞采用Western Blot法檢測CK18、AFP、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、色氨酸2，3-雙加氧酶(Tryptophan2，3-Dioxygenase，TPH2)的表達(dá)情況，采用ELISA法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALB的含量。
　　3.肝纖維化大鼠血液微環(huán)境誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究分離肝纖維化大鼠和正

7、常大鼠血清。取第三代HUCMSCs進(jìn)行分組培養(yǎng):肝纖維化大鼠血清組:含5ml/L肝纖維化大鼠血清的DMEM/F12(含10％FBS)培養(yǎng)基;正常大鼠血清組:含5ml/L正常大鼠血清的DMEM/F12(含10％FBS)培養(yǎng)基。對照組:DMEM/F12(含10％FBS)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)開始后于倒置顯微鏡下觀察并記錄各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;取誘導(dǎo)7d時的各組細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光檢測AFP、CK18的表達(dá)，采用Western Blot法檢測ALB、T

8、PH2、CYP3A4的表達(dá)，采用二乙酰肟比色法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中BUN的含量。
　　結(jié)果:
　　1.本研究第一部分，與對照組長梭形細(xì)胞相比，纖維化肝組織勻漿組細(xì)胞于誘導(dǎo)1d時即可見到細(xì)胞兩極回縮，胞體變短;誘導(dǎo)7d時，細(xì)胞呈不規(guī)則形或類圓形，胞體豐滿。Western Blot檢測示，對照組細(xì)胞未見AFP、CK18、CYP3A4表達(dá);勻漿組細(xì)胞可表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志物AFP、CK18及與代謝功能相關(guān)的重要蛋白CYP3A4。對照

9、組上清液中BUN、ALB濃度分別為(0.43±0.07)mmol/L和(8.08±0.41)μg/mL，勻漿組分別為(2.52±0.20)mmol/L和(41.48±4.11)μg/mL，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01;p＜0.01)。PAS染色示，對照組HUCMSCs細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色;勻漿組細(xì)胞整個胞體被染成深紫色，細(xì)胞核可見。
　　2.本研究第二部分，與對照組長梭形成纖維樣細(xì)胞相比，誘導(dǎo)7d時，纖維化肝組織

10、勻漿組及正常肝組織勻漿組細(xì)胞形態(tài)變化明顯，呈類圓形，胞體豐滿。與對照組相比，兩勻漿組細(xì)胞均可表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志物CK18和AFP。對照組細(xì)胞可表達(dá)少量CYP2E1，兩勻漿組細(xì)胞可表達(dá)CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝細(xì)胞功能蛋白，且CYP2E1的表達(dá)量較對照組明顯增加(p＜0.01)，而兩勻漿組上述蛋白的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05）。同時，兩勻漿組細(xì)胞分泌ALB的能力較對照組亦明顯增強(qiáng)(P＜0.01），

11、兩勻漿組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.本研究第三部分，誘導(dǎo)7d時，各組細(xì)胞均未見到明顯的形態(tài)學(xué)變化。肝纖維化大鼠血清組細(xì)胞可表達(dá)AFP、CK18等肝細(xì)胞標(biāo)志物及其功能蛋白ALB、THP2、CYP3A4，正常大鼠血清組和對照組細(xì)胞不表達(dá)上述蛋白。正常大鼠血清組細(xì)胞上清液中BUN濃度為(0.40±0.04)mmol/L，對照組為(0.38±0.04)mmol/L，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。肝纖維化大鼠血清

12、組BUN濃度為(0.74±0.07)mmol/L，顯著高于前兩組(p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠纖維化肝組織微環(huán)境可快速誘導(dǎo)HUCMSCs向肝細(xì)胞分化，形成的肝樣細(xì)胞不僅具備肝細(xì)胞表面標(biāo)志物，同時有肝藥酶的表達(dá)，并具有儲存糖原、合成BUN及分泌ALB的能力，可部分替代肝細(xì)胞功能，這可能是干細(xì)胞移植改善肝功能的機(jī)制之一。
　　2.纖維化肝組織微環(huán)境與正常肝組織微環(huán)境均可誘導(dǎo)HUCMSCs向肝細(xì)胞分化，在達(dá)到相