rhG-CSF動員對造血干細(xì)胞移植供者CD4+T細(xì)胞活化和LFA-1分子構(gòu)象影響的研究.pdf

1、研究背景:細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白基因家族成員之一,作用于細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附,可表達(dá)于多種細(xì)胞表面,其配體是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)和巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體-1(Mac-1),ICAM-1與其配體的相互作用,在白細(xì)胞選擇性黏附、游走、抗原遞呈和效應(yīng)T細(xì)胞行使功能中起重要作用；在炎癥部位,ICAM-1可增強(qiáng)表達(dá)于多譜系細(xì)胞表面,炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ等可上調(diào)和誘導(dǎo)其表達(dá)。研究ICAM-1在白細(xì)

2、胞細(xì)胞的表達(dá)情況有助于揭示病程演進(jìn)中的白細(xì)胞選擇性黏附分子機(jī)理,從不同的角度和層次揭示和闡明免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等遷移過程中的一些重要分子機(jī)理,同時為分子靶治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:構(gòu)建人細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)全長基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-ICAM-1,并轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)細(xì)胞株。
　　 方法:采用RT-PCR法從健康人外周血中分離單個核細(xì)胞中釣取ICAM-1全長基

3、因(1622bp),與pMD18-T載體連接做全自動序列測定。將測序正確的克隆質(zhì)粒pMD18-T-ICAM-1和表達(dá)載體pEGFP-C1分別用HindⅢ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切,應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建ICAM-1全長基因真核表達(dá)載體pEGFP-C1-ICAM-1,質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和SacⅡ雙酶切和PCR電泳鑒定后,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,G418篩選。ICAM-1_GFP/CHO細(xì)胞能連接PMA處理的Molt-4細(xì)胞。
　　 結(jié)果:

4、重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定得到與ICAM-1全長基因長度一致(1622bp)的酶切產(chǎn)物；測序分析證實,PCR產(chǎn)物與GenBank上登錄的ICAM-1基因(NM_000201)序列完全一致,表明成功地完成了ICAM-1的擴(kuò)增和表達(dá)載體的構(gòu)建；熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá),表達(dá)的融合蛋白較均勻的分布于整個細(xì)胞,FACS檢測ICAM-1_GFP的熒光轉(zhuǎn)染率為(13±5.5)％,表明ICAM-1_GFP基因進(jìn)入到CHO細(xì)胞