模擬微重力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移的影響及相關(guān)分子機(jī)理研究.pdf

1、空間生命科學(xué)是空間科學(xué)和生命科學(xué)相互滲透形成的一門交叉學(xué)科,主要研究宇宙空間環(huán)境對(duì)生命活動(dòng)的影響規(guī)律及機(jī)制。隨著空間科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,空間生命科學(xué)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)和前沿。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,可以在不同培養(yǎng)條件下分化成多種間質(zhì)細(xì)胞,也具有免疫兼容、定向遷移至損傷位點(diǎn)參與組織修復(fù)等特點(diǎn),是臨床細(xì)胞治療和組織工程的重

2、要種子細(xì)胞,對(duì)維持正常生命活動(dòng)有重要作用。
　　MSCs的生物學(xué)行為受多種環(huán)境因素的調(diào)控,除化學(xué)因素外,力學(xué)刺激對(duì)MSCs的生物學(xué)行為也有重要調(diào)節(jié)作用?？臻g環(huán)境與地面環(huán)境完全不同,失重是空間特殊環(huán)境的主要特點(diǎn)之一。隨著航天技術(shù)的發(fā)展和對(duì)太空探索需求的不斷增加,人類活動(dòng)已經(jīng)頻繁進(jìn)入外層空間?？臻g微重力環(huán)境引起宇航員骨鈣含量降低、肌肉系統(tǒng)萎縮、免疫系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng),了解空間微重力下MSCs生物學(xué)行為的變化特征及規(guī)律及其對(duì)人體生理活動(dòng)

3、的影響及機(jī)制,對(duì)預(yù)防和治療微重力引起的相關(guān)疾病具有重要意義。因此,本文采用地基微重力模擬裝置,主要考察模擬微重力對(duì)大鼠MSCs(rat MSCs,rMSCs)增殖和遷移行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)理。該研究主要有以下4個(gè)方面的內(nèi)容:
　　1. rMSCs的原代分離培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Percoll密度梯度離心法和差時(shí)貼壁法,從大鼠后肢股骨分離rMSCs。用該方法獲得的細(xì)胞傳代后0.5h即可貼壁,24h后完全鋪展,多呈長梭形或三角形。細(xì)胞具有

4、較強(qiáng)的增殖能力,3~5天即可接近融合,呈漩渦樣單層生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面相關(guān)抗原,結(jié)果顯示,細(xì)胞的CD44和CD90呈陽性,CD34呈陰性,符合MSCs表面標(biāo)記抗原的一般規(guī)律。
　　2.微重力效應(yīng)模擬裝置本實(shí)驗(yàn)采用中國科學(xué)院力學(xué)所微重力重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的平行平板旋轉(zhuǎn)微重力效應(yīng)模擬裝置,其主體結(jié)構(gòu)包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)腔和產(chǎn)生水平旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)力的單軸旋轉(zhuǎn)支架。該裝置的基本原理是通過細(xì)胞繞水平軸的旋轉(zhuǎn),當(dāng)轉(zhuǎn)速快于細(xì)胞重力方向的時(shí)間

5、閾值時(shí),細(xì)胞因喪失或者降低對(duì)固定重力方向的感知而產(chǎn)生類似于空間微重力下的生物學(xué)效應(yīng)。
　　3.模擬微重力對(duì)rMSCs增殖行為的影響及相關(guān)分子機(jī)理細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8試劑盒檢測模擬微重力對(duì)rMSCs增殖的影響,發(fā)現(xiàn)模擬微重力1天對(duì)rMSCs增殖沒有明顯影響,模擬微重力3天、5天明顯抑制rMSCs增殖。
　　RT-PCR檢測模擬微重力對(duì)rMSCs中cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,模擬微重力顯著抑制rMS

6、Cs中cyclin D1 mRNA的表達(dá)。模擬微重力作用下rMSCs中β-catenin mRNA的表達(dá)沒有明顯變化。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)模擬微重力作用下MSCs的細(xì)胞質(zhì)中游離的β-catenin明顯下降,并且β-catenin向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移量也降低。模擬微重力環(huán)境顯著下調(diào)MSCs中Wnt3a mRNA的表達(dá),但不影響DKK-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明,微重力可能通過抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制rMSCs增殖。
　　4.模擬微重力對(duì)r

7、MSCs遷移行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)理Transwell跨膜遷移模型和劃痕遷移模型考察了模擬微重力對(duì)rMSCs遷移能力的影響。結(jié)果顯示,模擬微重力作用24h后rMSCs的劃痕遷移能力受到明顯抑制,恢復(fù)重力24h并沒有恢復(fù)rMSCs的遷移能力。此外,不管是在無血清培養(yǎng)基還是1％血清培養(yǎng)基的誘導(dǎo)條件下,模擬微重力24 h后rMSCs的跨膜遷移能力都受到明顯抑制。
　　進(jìn)一步研究了模擬微重力影響rMSCs遷移行為的機(jī)理。原子力顯微鏡檢測

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn),模擬微重力作用24h顯著提高rMSCs的楊氏模量,恢復(fù)重力24h后,上調(diào)的楊氏模量明顯恢復(fù)。免疫熒光染色考察模擬微重力對(duì)rMSCs中F-actin的影響,結(jié)果顯示,模擬微重力作用24h明顯促進(jìn)F-actin細(xì)胞骨架的表達(dá)和聚合,恢復(fù)重力24h后,rMSCs中F-actin細(xì)胞骨架明顯下調(diào)。結(jié)果表明,模擬微重力下rMSCs遷移能力的下降可能與細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞硬度變化有關(guān)。
　　本文研究結(jié)果表明,模擬微重力可能通過下調(diào)Wn