產(chǎn)甲殼素酶菌株HD001的篩選、發(fā)酵及酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、甲殼素是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的多糖，是多數(shù)真菌細(xì)胞壁、無脊椎動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物外骨骼以及昆蟲體表和昆蟲中腸圍食膜的主要結(jié)構(gòu)成分，是自然界多糖生物合成量?jī)H次于纖維素的第二大天然資源，其降解產(chǎn)物具有多種用途。甲殼素酶能夠催化水解N-乙酰-D-葡萄糖胺糖苷鍵，降解甲殼素得到幾丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖。甲殼素酶廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物細(xì)胞和組織中，從微生物中篩選產(chǎn)甲殼素酶菌株，并進(jìn)行酶的研究，

2、不僅具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值，而且對(duì)于自然資源利用、生物防治、環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展都具有重要的實(shí)際意義。 本研究以篩選高產(chǎn)甲殼素酶菌株為目的，從海洋泥樣中分離、篩選出一株產(chǎn)甲殼素酶的菌株，命名為HD001，該菌在以膠體甲殼素為唯一碳源的平板上能產(chǎn)生較高活性的甲殼素酶。 通過對(duì)菌株HD001的發(fā)酵條件研究，確定了其產(chǎn)甲殼素酶最適培養(yǎng)基組分為(W/V)：(NH4)2SO4 2.0％、NaCl 0.5％、K2HPO4 0

3、.07％、KH2PO4 0.03％、MgS04-7H2O 0.05％、葡萄糖0.1％、酵母粉0.3％、膠體甲殼素1.5％；最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基起始pH值6.0，接種量1.0％(v/v)，以500mL，三角瓶裝瓶量為150mL，培養(yǎng)溫度30℃，160r/min搖瓶培養(yǎng)120h，發(fā)酵液酶活力可達(dá)1.7U/mL。 在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌株HD001，發(fā)酵液冷凍離心，上清液采用30％～90％硫酸銨分級(jí)鹽析、透析、冷凍干燥后制得甲殼

4、素酶粗酶，粗酶經(jīng)DEAE-纖維素離子交換層析、Sephacryl S-100凝膠過濾層析分離純化，制得電泳純的甲殼素酶，酶純化倍數(shù)為11.98，收率為28.1％。SDS-PAGE電泳顯示單一條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為85.7kDa。 對(duì)甲殼素酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明該甲殼素酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為5.6：酶活力在pH 5.5～7.0時(shí)相對(duì)穩(wěn)定；25℃放置24h酶活力基本不變。Mg2+對(duì)酶的活性有促進(jìn)作用，Zn