LPS-LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合位點(diǎn)噬菌體克隆的篩選.pdf

1、脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性細(xì)菌外壁的主要成分，可致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征，目前尚無(wú)理想的抗內(nèi)毒素治療藥物。正常情況時(shí)人體內(nèi)LPS的水平很低，即使在革蘭陰性菌膿毒血癥時(shí)，血漿中LPS濃度僅為0.01～1ng/ml[1]。LPS發(fā)揮致炎作用需要LBP/CD14的增敏效應(yīng)。脂多糖結(jié)合蛋白是脂多糖的結(jié)合蛋白，能將LPS單體轉(zhuǎn)運(yùn)至脂蛋白后通過(guò)肝臟從體內(nèi)清除，并可以將LPS遞呈給位于單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面的受體CD14，形成LPS/L

2、BP/CD14三聯(lián)復(fù)合物，啟動(dòng)LPS炎癥信號(hào)通路，誘發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥效應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)毒素性急性呼吸窘迫綜合征。LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合是啟動(dòng)LPS炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵點(diǎn)，尋找LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)模擬肽，可以早期阻斷LPS炎癥信號(hào)通路。因此，本研究擬構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物，并以LPS/LBP復(fù)合物為底物進(jìn)行噬菌體十二肽庫(kù)篩選，獲得與LPS/LBP復(fù)合物具有較高親和力，并與CD14競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆

3、。擬通過(guò)后續(xù)DNA測(cè)序后獲得LPS/LBP復(fù)合物與CD14的結(jié)合位點(diǎn)的模擬肽，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)毒性急性呼吸窘迫征的防治策略奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　構(gòu)建LPS/LBP復(fù)合物，篩選LPS/LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合位點(diǎn)的噬菌體克隆。
　　方法：
　　1.將LPS與LBP按15∶1、10∶1、5∶1的比例混勻。將LPS/LBP混合物、LBP(濃度分別為200ug/ml和100ug/ml、50ug/ml)、LPS(

4、濃度分別為100ug/ml、50ug/ml)過(guò)夜孵育。將LPS/LBP混合物、LBP、LPS行凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后將各條帶切取，行蛋白回收，并測(cè)定內(nèi)毒素。
　　2.采用噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)，以LPS/LBP復(fù)合物包被酶標(biāo)板，行親和篩選，經(jīng)過(guò)4輪洗脫，使噬菌體得到有效富集。隨后分次挑取47個(gè)和95個(gè)噬菌體克隆，行結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)，將親和活性大于2倍以上的噬菌體克隆行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，最終得到與LPS/LBP復(fù)合物有親和力且能與CD14

5、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物的噬菌體克隆。
　　結(jié)果：
　　1.凝膠電泳后，LPS/LBP復(fù)合物、LBP泳道于52KDa處可見(jiàn)考馬斯亮蘭染色的條帶。樣本中LBP濃度越高、條帶染色越濃，LPS泳道對(duì)應(yīng)于52KDa處無(wú)染色條帶出現(xiàn)。各濃度比例的LPS/LBP復(fù)合物電泳后凝膠條帶回收物中均能檢測(cè)出內(nèi)毒素。10∶1LPS/LBP復(fù)合物組、15∶1LPS/LBP復(fù)合物組復(fù)合物內(nèi)毒素濃度顯著高于5∶1LPS/LBP復(fù)合物組內(nèi)毒素濃度(

6、P＜0.05)。10∶1LPS/LBP復(fù)合物組與15∶1LPS/LBP復(fù)合物組內(nèi)毒素濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.1)。各濃度LBP組均未檢出內(nèi)毒素，LPS組內(nèi)毒素檢測(cè)也為陰性。
　　2.以LPS/LBP復(fù)合物為底物行親和篩選，經(jīng)過(guò)4輪洗脫，富集率由2.35×106增加到4.25×10-5，噬菌體克隆得到有效富集。第一次結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選47個(gè)克隆進(jìn)行ELISA鑒定其與LPS/LBP復(fù)合物的的結(jié)合力，結(jié)果顯12個(gè)噬菌體克隆所展示的多

7、肽與LPS/LBP復(fù)合物有較高的結(jié)合力，OD450高于對(duì)照組2倍以上。第二次結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑取95個(gè)噬菌體克隆行結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)，34個(gè)噬菌體克隆與LPS/LBP復(fù)合物有較高親和力，OD450高于對(duì)照組2倍以上。將這46個(gè)噬菌體克隆行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，有34個(gè)噬菌體能與CD14競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS/LBP復(fù)合物，競(jìng)爭(zhēng)抑制力較高的是2-27、2-34、2-50這三個(gè)噬菌體克隆。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)溫孵及凝膠電泳可獲得純度較高的LP