內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激--CHOP-CaMKⅡ通路介導(dǎo)分子氫心肌保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景：
　　心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，IR)使心肌細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致再灌注后心功能不全，是制約心血管手術(shù)臨床療效的重要因素。如何有效地降低IR后心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌損傷，保護(hù)心功能，一直都是心血管領(lǐng)域基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。近來研究發(fā)現(xiàn)，心肌IR時會引起嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic retic

2、ulum stress，ERS)，誘發(fā)氧化型鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ（ox-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，ox-CaMKⅡ）激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。心肌IR發(fā)生時，CaMKⅡ能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載而加重心肌IR損傷。晚近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)新型氣體分子氫(Hydrogen，H2)可以在IR中選擇性抗氧化而發(fā)揮保護(hù)作用。我們推測，H2可能通過減少心肌IR后ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)ERS，降低CaM

3、KⅡ的活化，減少細(xì)胞Ca2+([Ca2+]i)，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)心功能的作用。
　　二、研究目的：
　　1、明確分子氫在心肌IR損傷中的心肌保護(hù)作用;
　　2、闡明分子氫在心肌IR中保護(hù)心肌的分子機(jī)制。
　　三、研究方法：
　?。ㄒ唬〩2調(diào)節(jié)ERS影響細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　乳鼠心肌細(xì)胞先經(jīng)低氧（1％氧氣+5％二氧化碳+94％氮?dú)猓┡囵B(yǎng)30min，然后正常（5％二氧化碳

4、+95％空氣）培養(yǎng)120min，以建立細(xì)胞缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，HR)模型。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞隨機(jī)分為3組:Con組、HR組和H2組(先使用0.6mM富氫DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min，再進(jìn)行HR)。
　　采用CCK-8測定心肌細(xì)胞活力，二硝基苯肼比色法測定培養(yǎng)液上清中LDH含量，ELISA法測定培養(yǎng)液上清中cTnⅠ含量，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，以及Westernblot檢測CHOP、Bcl-2和Bax蛋白

5、的表達(dá)水平。
　?。ǘ〩2調(diào)節(jié)ERS-CaMKⅡ-Ca2+超載影響細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
　　1、CHOP介導(dǎo)H2影響CaMKⅡ氧化激活的研究
　　構(gòu)建大鼠CHOP基因過表達(dá)慢病毒載體(Lv-CHOP)和CHOP基因短發(fā)卡RNA（shRNA）慢病毒載體(Lv-shRNA)，分別轉(zhuǎn)染乳鼠離體心肌細(xì)胞以上調(diào)或下調(diào)CHOP的表達(dá)水平。采用與第1部分相同方法構(gòu)建離體細(xì)胞HR模型。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞隨機(jī)分為7組:Con組、HR組、H2組、H

6、R+Lv-CHOP組（采用Lv-CHOP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，處理同HR組）、HR+Lv-CHOP+H2組（采用Lv-CHOP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，處理同H2組）、HR+Lv-shRNA組（采用Lv-shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，處理同HR組）和HR+Lv-shRNA+H2組（采用Lv-shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，處理同H2組）。采用Western blot檢測ox-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白的表達(dá)水平。
　　2、CaMKⅡ介導(dǎo)H2影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的研究

7、r>　　同第1部分方法建立離體心肌細(xì)胞HR模型，使用KN-93特異性阻滯CaMKⅡ激活。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞隨機(jī)分成5組:Con組、HR組、H2組、HR+ KN-93組（細(xì)胞先在含2μM KN-93的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)30min，后處理同HR組）和HR+H2+ KN-93組（細(xì)胞先在含2μM KN-93的富氫DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)30min，后處理同HR組）。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+([Ca2+]i)和細(xì)胞凋亡率，以及Western bl

8、ot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平。
　?。ㄈ〩2調(diào)節(jié)ERS影響細(xì)胞凋亡的在體驗(yàn)證研究
　　通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支缺血30min，隨后再通恢復(fù)灌注120min建立大鼠心肌IR模型。30只SD大鼠隨機(jī)分為3組:Sham組（只進(jìn)行開胸手術(shù)）、IR組和H2組（再灌注前5min給予腹腔注射10mL/kg富氫生理鹽水）。
　　再灌注后120min測定大鼠的左心室收縮壓(LVSP)和左心室等容收縮期壓力最大變化速率（+d

9、p/dtmx），Evans-Blue/TCC雙染色測定心肌梗死面積。采用免疫組織化學(xué)法測定心肌中8-OHdG和3-NT的陽性表達(dá)指數(shù)，二硝基苯肼比色法測定血清中LDH含量，ELISA測定血清中cTnⅠ含量，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，以及Western blot檢測CHOP、ox-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。
　　四、研究結(jié)果：
　　（一）H2調(diào)節(jié)ERS影響細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、

10、H2改善心肌細(xì)胞HR后細(xì)胞活力
　　各組心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為:Con98.8±1.0％，HR32.6±5.2％，H259.3±3.9％，其中H2組顯著高于HR組(P＜0.001)，提示H2可改善心肌細(xì)胞HR后細(xì)胞活力。
　　2、H2減少心肌細(xì)胞HR后損傷
　　各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量分別為:Con12.2±1.7 U/L，HR24.7±3.1U/L，H219.3±2.9 U/L，其中H2組顯著低于HR組(

11、P=0.047);各組培養(yǎng)液上清中cTnⅠ含量分別為:Con68.2±8.8 ng/L，HR127.8±16.6 ng/L，H295.7±7.6 ng/L，其中H2組顯著低于HR組（P=0.015），提示H2可減少心肌細(xì)胞HR后損傷。
　　3、H2減少心肌細(xì)胞HR后細(xì)胞凋亡
　　與Con組相比，HR組Bcl-2/Bax比值顯著降低(P＜0.001)，而H2組Bcl-2/Bax比值顯著高于HR組(P＜0.001)，提示H2在心

12、肌細(xì)胞HR后可通過升高Bcl-2/Bax比值而減少細(xì)胞凋亡。
　　各組心肌細(xì)胞凋亡率分別為:Con7.7±1.6％，HR87.7±9.0％，H268.9±9.6％，其中H2組顯著低于HR組(P=0.024)，提示H2可減少心肌細(xì)胞HR后細(xì)胞凋亡率。
　　4、H2影響心肌細(xì)胞HR后ERS，降低CHOP表達(dá)
　　與Con組相比，HR組ERS相關(guān)蛋白CHOP表達(dá)顯著升高(P＜0.001)，而H2組CHOP表達(dá)顯著高于HR組(

13、P＜0.001)，提示H2影響心肌細(xì)胞HR后ERS，降低CHOP表達(dá)水平。
　?。ǘ〩2調(diào)節(jié)ERS-CaMKⅡ-Ca2+超載影響細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
　　1、CHOP介導(dǎo)H2對心肌細(xì)胞CaMKⅡ氧化激活水平的影響
　　與Con組相比，HR組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P＜0.001)，而H2組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著低于HR組(P＜0.001)，提示H2可降低細(xì)胞HR后CaMKⅡ氧化激活（即ox

14、-CaMKⅡ）水平。當(dāng)上調(diào)CHOP表達(dá)（即HR+Lv-CHOP組），與HR組相比，ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P=0.002)，在此基礎(chǔ)上再給予氫（即HR+Lv-CHOP+H2組），與HR+Lv-CHOP組相比，ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值降低(P＜0.001)，但與HR組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.163);當(dāng)下調(diào)CHOP表達(dá)（即HR+Lv-shRNA組），與HR組相比，ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著降低(P＜0

15、.001)，在此基礎(chǔ)上再給予氫（即HR+Lv-shRNA+H2組），與HR+Lv-shRNA組相比，ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著降低(P＜0.001)，且與H2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.940），提示CHOP介導(dǎo)H2對CaMKⅡ氧化激活水平的影響。
　　2、CaMKⅡ介導(dǎo)H2對心肌細(xì)胞[Ca2+]i水平的影響
　　與Con組相比，HR組[Ca2+]i水平顯著升高(P＜0.001)，而H2組[Ca2+]i水平顯著低于HR

16、組(P＜0.001)，提示H2可降低細(xì)胞HR后[Ca2+]i水平。當(dāng)KN-93抑制CaMKⅡ激活（即HR+KN-93組），與HR組相比，[Ca2+]i水平顯著降低(P＜0.001)，在此基礎(chǔ)上再給予氫（即HR+KN-93+H2組），與HR+KN-93組相比，[Ca2+]i水平顯著降低(P=0.001)，且與H2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.143)，提示CaMKⅡ介導(dǎo)H2對[Ca2+]i水平的影響。
　　3、CaMKⅡ介導(dǎo)H2對心肌細(xì)胞

17、凋亡的影響
　　與HR組相比，HR+KN-93組Bcl-2/Bax比值顯著升高(P=0.004)，而HR+KN-93+H2組Bcl-2/Bax比值顯著高于HR+KN-93組(P=0.030)，且與H2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.372)，提示CaMKⅡ介導(dǎo)H2對Bcl-2/Bax比值的影響。
　　同樣地，與HR組相比，HR+KN-93組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.001)，而HR+KN-93+H2組細(xì)胞凋亡率顯著低于HR+KN-

18、93組(P＜0.001)，且與H2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.272)，提示CaMKⅡ介導(dǎo)H2對細(xì)胞凋亡率的影響。
　　（三）H2調(diào)節(jié)ERS影響細(xì)胞凋亡的在體驗(yàn)證研究
　　1、H2減少心肌IR后羥自由基(·OH)和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)
　　反映·OH水平的8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)在各組心肌中的陽性表達(dá)指數(shù)分別為:Sham4.3±0.8％，IR89.1±0.8％，H254.9±5.0％，其中H2組顯著低于

19、IR組(P＜0.001);反映ONOO-水平的3-硝基酪氨酸(3-NT)在各組中的陽性表達(dá)指數(shù)分別為:Sham9.7±0.8％，IR86.7±5.2％，H263.4±7.4％，同樣的，H2組顯著低于IR組(P＜0.001)，提示H2減少心肌IR中·OH和ONOO-的含量。
　　2、H2影響心肌IR后ERS，降低CHOP表達(dá)
　　與Sham組相比，IR組CHOP表達(dá)水平顯著升高(P＜0.001)，而H2組CHOP表達(dá)水平顯著低

20、于IR組（P=0.001），證實(shí)H2可調(diào)控ERS，降低心肌IR后CHOP表達(dá)。
　　3、H2降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平
　　與Sham組相比，IR組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著升高(P＜0.001)，而H2組ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值顯著低于IR組(P＜0.001)，證實(shí)H2可降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平。
　　4、H2減少心肌IR后細(xì)胞凋亡
　　與Sham組相比，IR組Bcl-2

21、/Bax比值顯著降低(P＜0.001)，而H2組Bcl-2/Bax比值顯著高于IR組(P=0.003)，證實(shí)H2在心肌IR后可通過升高Bcl-2/Bax比值而減少細(xì)胞凋亡。
　　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為:Sham4.6±1.1％，IR42.7±5.7％，H228.1±6.9％。其中H2組顯著低于IR組(P=0.001)，證實(shí)H2可減少心肌IR后細(xì)胞凋亡數(shù)。
　　5、H2降低心肌IR后損傷
　　各組大鼠血清中LDH

22、含量分別為:Sham2195.4±167.6 U/L，IR4159.7±243.1 U/L,H23699.4±182.7 U/L，其中H2組顯著低于HR組(P=0.003);各組大鼠血清中cTnⅠ含量分別為:Sham35.4±3.5 ng/L，IR150.5±18.4 ng/L，H2121.6±13.8 ng/L，其中H2組顯著低于HR組(P=0.005)，證實(shí)H2可減少心肌IR后損傷。
　　6、H2減少心肌IR后梗死面積

23、　　與IR組相比，H2組心肌梗死區(qū)面積/危險區(qū)面積(INF/AAR)顯著降低（22.4±2.9vs48.4±3.5％，P＜0.001），證實(shí)H2可減少心肌IR后梗死面積。
　　7、H2改善心肌IR后心功能
　　體現(xiàn)左心室心肌收縮能力的LVSP和+dp/dtmax在IR組均顯著低于Sham組(92.4±6.3 vs131.8±8.1 mmHg，P＜0.001;3601.2±339.6 vs8563.4±514.6 mmHg/s

24、,P＜0.001)，而H2組的LVSP和+dp/dtmax較IR組顯著提高（120.0±9.7 vs92.4±6.3mmHg，P＜0.001;5801.0±816.8 vs3601.2±339.6 mmHg/s，P＜0.001），證實(shí)H2可改善心肌IR后左心室心肌收縮能力，保護(hù)心功能。
　　五、研究結(jié)論：
　　1、心肌IR能激活ERS，增加心肌細(xì)胞的凋亡;
　　2、H2可通過減輕心肌IR后ERS，下調(diào)CHOP表達(dá)，降低