鋅離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑誘導(dǎo)心肌保護(hù)中的作用.pdf

1、目的:
　　探討ERS抑制劑TUDCA是否通過Zn2+發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　方法:
　　首先，以大鼠胚胎心臟組織來源H9c2細(xì)胞株作為本實驗研究對象，同時用H2O2處理細(xì)胞造成細(xì)胞的ERS反應(yīng)。Western blot法檢測H2O2處理H9c2細(xì)胞后ERS的伴侶分子 GRP78、GRP94的表達(dá)情況，進(jìn)一步采用激光掃描共聚焦顯微鏡成像法測定外源性ZnCl2和TUDCA對H9c2細(xì)胞中Zn2+濃度的影響及TUDCA及T

2、PEN對 H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的改變進(jìn)而判斷mPTP的開放程度。其次，以健康雄性Wistar大鼠作為實驗對象，應(yīng)用Langendorff裝置成功制備大鼠離體心臟缺血/再灌注模型。用Western blot和免疫熒光法檢測TUDCA和TPEN對ERS伴侶分子GRP78表達(dá)的影響。最后，用HE染色法觀察TUDCA和TPEN對心臟組織形態(tài)學(xué)的影響及透射電鏡觀察TUDCA和TPEN對心肌超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.H9

3、c2細(xì)胞用不同濃度ZnCl2（1、5、10μΜ）處理10 min后，Zn2+特異性熒光染料Newport Green DCF熒光強度與正常對照組（82.2±3.2％）相比均明顯增加（分別為135.1±11.6%、141.7±8.5%、157.1±20.7%），并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明外源性 ZnCl2能夠使細(xì)胞內(nèi)游離Zn2+濃度增多。后續(xù)實驗均以ZnCl2作為陽性對照組，并以有統(tǒng)計學(xué)意義的最小濃度作為后續(xù)實驗的陽性對

4、照。
　　2.細(xì)胞用TUDCA處理10 min后，與正常對照組（82.2±3.2%）相比，TUDCA組 Newport Green DCF熒光強度明顯增加（112.7±5.4%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與 ZnCl2組相比增加趨勢較一致。說明TUDCA能夠模擬外源性鋅引起細(xì)胞內(nèi)游離Zn2+濃度的增加。
　　3.細(xì)胞用H2O2（800μM）處理20 min后，用Western blot檢測ERS伴侶分子GRP78

5、、GRP94的表達(dá)情況，與空白對照組（100.0±12.8%、100.0±7.9%）相比，H2O2組GRP78、GRP94的表達(dá)明顯增加（296.2±41.0%、150.6±13.5%），說明800μΜ H2O2能夠引起細(xì)胞ERS，后續(xù)實驗均采用此濃度H2O2制備ERS模型。
　　4.細(xì)胞用H2O2（800μM）處理細(xì)胞后線粒體探針 TMRE熒光強度與空白對照組（92.6±0.1%）相比明顯減弱（40.6±7.4%），提示ERS發(fā)

6、生可引起mPTP的開放。與H2O2組相比，TUDCA（30μM）能夠明顯抑制TMRE熒光強度的減少（77.8±6.8%），提示抑制ERS可阻止mPTP的開放。TUDCA抑制TMRE熒光強度減少的作用能夠被Zn2+螯合劑TPEN所阻斷（37.0±13.0%），提示Zn2+可能介導(dǎo)TUDCA抑制mPTP開放的作用。
　　5.心臟組織 Western blot結(jié)果顯示，再灌注10 min各組間無明顯差別。隨著再灌注時間延長，與Sham組

7、相比，再灌注30 min、60 min I/R組GRP78表達(dá)明顯增加（191.3±25.3%、139.0±7.3%），提示缺血/再灌注可以引起ERS。與I/R組相比，TUDCA能夠明顯降低GRP78表達(dá)（105.2±8.1%、101.2±6.2%），說明TUDCA能夠抑制再灌注誘發(fā)的ERS。TUDCA抑制GRP78表達(dá)的作用被Zn2+螯合劑TPEN所阻斷（183.5±22.0%、131.2±5.4%），提示Zn2+可能介導(dǎo)TUDCA抑

8、制ERS的作用。
　　6.免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組GRP78綠色熒光強度明顯增高，TUDCA能夠明顯降低綠色熒光的強度，說明TUDCA可以抑制ERS伴侶分子GRP78的表達(dá)。TUDCA降低GRP78表達(dá)的作用能夠被Zn2+螯合劑TPEN所逆轉(zhuǎn)，說明 Zn2+可能介導(dǎo)TUDCA抑制ERS的作用，這一結(jié)果與Western blot結(jié)果相一致。
　　7.HE染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組心臟組織肌纖維

9、間隙增寬，排列紊亂、斷裂。給予TUDCA后心肌纖維排列較整齊，斷裂較少，間隙稍有增寬。說明TUDCA能夠保護(hù)再灌注心肌。TUDCA的心肌保護(hù)作用被 Zn2+螯合劑TPEN所逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步提示Zn2+可能介導(dǎo)TUDCA的心肌保護(hù)作用。
　　8.透射電鏡結(jié)果也顯示，與Sham組相比，再灌注10 min I/R組肌絲排列紊亂，線粒體結(jié)構(gòu)尚完整，部分線粒體腫大，線粒體嵴清晰可見，僅見嵴間隙的增寬，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。再灌注30 min I/R組

10、肌絲溶解破壞甚至消失，Z線不清，線粒體腫大，雙層膜融合模糊不清甚至破裂，嵴斷裂、溶解、消失，線粒體部分空泡樣變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴張呈大泡樣，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒等。給予TUDCA后線粒體結(jié)構(gòu)較完整，部分線粒體仍有腫脹，但線粒體嵴完整清晰，偶見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張，說明TUDCA可以保護(hù)再灌注心肌。而這種TUDCA的心肌保護(hù)作用可被TPEN所逆轉(zhuǎn)，說明Zn2+介導(dǎo)TUDCA的心肌保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　ERS抑制劑TUDCA通過增加細(xì)胞內(nèi)