利用多種細(xì)胞篩選抗氧化物質(zhì)方法的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境污染日益嚴(yán)重,日常生活中接觸的氧化應(yīng)激源的種類和頻率較之前有大幅增加。氧化應(yīng)激機(jī)制及防護(hù)成為近年來保健品和個人護(hù)理用品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。外源性的多種氧化應(yīng)激源會攻擊生物分子、蛋白、脂質(zhì)或核酸,造成細(xì)胞的氧化損傷,直接或間接地導(dǎo)致多種病理反應(yīng)的出現(xiàn)。紫外線照射和化學(xué)污染物造成的氧化應(yīng)激與皮膚的老化、色素沉著、炎癥及多種疾病的關(guān)系已得到充分的證明。許多化妝品公司推出了多種宣稱可以清除氧化自由基、延

2、緩皮膚衰老的產(chǎn)品,但對其是否能達(dá)到宣稱的效果至今尚無標(biāo)準(zhǔn)化的評價方法。另一方面,從植物提取物、化學(xué)合成、生物轉(zhuǎn)錄等途徑獲得的活性原料也需要建立一套科學(xué)高效的篩查方法。本研究旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞氧化損傷快速檢測方法,用于化學(xué)物或化妝品的抗氧化功效性評價。
　　目前,對于氧化反應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識尚未完全明確,但可以認(rèn)為氧化損傷涉及多通路和多基因聯(lián)合作用的復(fù)雜生物學(xué)過程。其中氧化損傷過程中的一些重要的靶細(xì)胞、限制酶、中間體和產(chǎn)物是關(guān)鍵的篩查指

3、針和標(biāo)志物。因而可根據(jù)氧化反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制建立抗氧化合物檢測和篩查的方法。抗氧化物質(zhì)研究方法可歸納為動物模型法、人體評價法、化學(xué)檢測法和細(xì)胞法四種,各有其特點(diǎn)和不足。特別是在提倡動物福利、避免不必要的動物實(shí)驗(yàn)的背景下,建立科學(xué)、高效和快速的方法是優(yōu)先選擇。本研究以多種細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象,模擬夏日日光輻射類型誘發(fā)細(xì)胞的氧化損傷模型,建立快速篩查方法。以正常皮膚HaCaT角質(zhì)細(xì)胞系、原代人皮膚成纖維細(xì)胞為對象,通過對紫外線照射細(xì)胞后引起氧化損

4、傷的多種生物標(biāo)志的檢測判斷物質(zhì)的抗氧化性;以H2O2誘導(dǎo)Coca-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,判斷物質(zhì)的對于不同細(xì)胞類型是否具有相同的抗氧化性;同時,使用Episkin皮膚模型,對該模型能否應(yīng)用于抗氧化物質(zhì)的篩選進(jìn)行了初步探索。
　　研究目的：
　　以體外培養(yǎng)的HaCaT角質(zhì)細(xì)胞、原代人皮膚成纖維細(xì)胞、Coca-2細(xì)胞和Episkin皮膚模型為對象,分別造成紫外線及H2O2誘發(fā)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,通過監(jiān)測添加待測物質(zhì)后細(xì)胞凋亡情況、

5、細(xì)胞周期阻滯情況、活性氧族(ROS)水平和超氧化物岐酶(SOD)水平的檢測,建立利用多種細(xì)胞篩選抗氧化物質(zhì)的方法,提供抗氧化特性的預(yù)測和評價。
　　研究內(nèi)容與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):
　　HaCaT細(xì)胞:使用MEM培養(yǎng)基,加入10％的新生牛血清;原代人皮膚成纖維細(xì)胞:使用DMEM培養(yǎng)基,加入10%的胎牛血清;Coca-2細(xì)胞:使用DMEM培養(yǎng)基,加入12%的胎牛血清;Episkin皮膚模型:使用MEM培養(yǎng)基。為皮膚模

6、型自帶培養(yǎng)基。細(xì)胞定量接種于75cm2培養(yǎng)瓶或直徑為65mm培養(yǎng)皿中;皮膚模型使用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、篩查物質(zhì):
　　POCI:植物提純物,主要成分為原花青素;LBPC:植物提純物,主要成分為枸杞多糖;FFNT:化學(xué)衍生物;C36D:化學(xué)衍生物。
　　3、氧化損傷模型及篩查物質(zhì)細(xì)胞毒性暴露劑量確定:使用MTT法分別測定不同紫外線輻照劑量對HaCaT細(xì)胞、原代人皮膚

7、成纖維細(xì)胞和皮膚模型的細(xì)胞存活率的影響;測量不同濃度的H2O2對Coca-2細(xì)胞存活率的影響,確定試驗(yàn)輻照劑量及H2O2濃度。測定各待測物質(zhì)的細(xì)胞毒性劑量,為試驗(yàn)提供濃度劑量選擇依據(jù)。
　　4、抗氧化特性篩查:分別用紫外線或化學(xué)物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,分別加入篩查物質(zhì),通過監(jiān)測不同的指標(biāo)預(yù)測篩查物質(zhì)的抗氧化特性。試驗(yàn)設(shè)立空白對照組,模型組,抗壞血酸組陽性對照組和待測物質(zhì)組,其中HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞檢測了4種物質(zhì),C

8、oca-2細(xì)胞檢測了2種物質(zhì)。
　　4.1、氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷的檢測指標(biāo):用熒光探針(DCFH-DA)標(biāo)記ROS的方法測定細(xì)胞內(nèi)ROS的生成情況,使用酶生化法測定SOD的水平,使用PI熒光染料標(biāo)記法測定細(xì)胞周期,使用Annexinv/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡。選用抗壞血酸為陽性對照,用以評價待這四項指標(biāo)是否穩(wěn)定且敏感。
　　4.2、氧化損傷作用篩查:紫外線及H2O2造模后,分別檢測加入待測物質(zhì)進(jìn)行干預(yù)后上述的四項指標(biāo),對各指標(biāo)變

9、化進(jìn)行評價,考察待測物質(zhì)是否能夠?qū)ρ趸瘧?yīng)激產(chǎn)生拮抗作用,并評價物質(zhì)的抗氧化能力的強(qiáng)弱。為對待測物質(zhì)抗氧化特性及強(qiáng)度的預(yù)測提供依據(jù)。
　　5、統(tǒng)計方法:各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SAS9.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。多組之間差異的比較用單因素的方差分析,組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)法,顯著性水平α=0.05,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用ModfitLT軟件對細(xì)胞周期結(jié)果進(jìn)行分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、氧化損

10、傷模型的建立:
　　本研究建立的多種細(xì)胞氧化損傷模型,對于皮膚細(xì)胞或組織采用紫外線照射法,對腸上皮細(xì)胞采用化合物暴露法。當(dāng)UVA劑量為5J/cm2,UVB劑量為0.6J/cm2時,能夠抑制20%的HaCaT細(xì)胞生長;當(dāng)UVA劑量為8J/cm2,UVB劑量為1J/cm2時,能夠抑制20%的原代人成纖維細(xì)胞生長;當(dāng)H2O2濃度為150μmol/L時,能夠抑制20%的Coca-2細(xì)胞生長,在上述劑量下,細(xì)胞產(chǎn)生一定氧化應(yīng)激損傷,但仍保持

11、一定的增殖活力,適合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
　　當(dāng)UVA劑量分別為0J/cm2,5J/cm2,15J/cm2,25J/cm2,35J/cm2,45J/cm2時,UVB劑量約為0J/cm2,1J/cm2,3J/cm2,5J/cm2,7J/cm2,9J/cm2時,Episkin皮膚模型中細(xì)胞存活率存在劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　2、待測物質(zhì)細(xì)胞毒性劑量確定:
　　對物質(zhì)抗氧化性的研究應(yīng)建立在其對細(xì)胞無毒性作用的濃度范圍內(nèi)。對于HaCaT

12、細(xì)胞,抗壞血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在400mg/L,FFNT8mg/L,C36D90mg/L濃度時可以抑制約10%細(xì)胞的增殖;對于原代人成纖維細(xì)胞,抗壞血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在300mg/L,FFNT在6mg/L,C36D在90mg/L濃度時可以抑制約10%細(xì)胞的增殖;對于Coca-2,抗壞血酸在100μmol/L,POCI在50mg/L,LBPC在300mg/L濃度

13、時可以抑制約10%細(xì)胞的增殖。
　　3、抗氧化損傷作用評價
　　3.1、ROS熒光強(qiáng)度水平
　　抗壞血酸作為陽性對照,其能夠明顯降低添加物質(zhì)組的ROS熒光強(qiáng)度水平。對于HaCaT細(xì)胞,抗壞血酸組,POCI組及LBPC組細(xì)胞ROS水平較空白對照組高,但較模型組低,FFNT組及C36D組細(xì)胞ROS水平與模型組無差異,且較空白對照組高;原代人成纖維細(xì)胞經(jīng)過紫外線輻照后,其ROS水平高于其余兩組細(xì)胞,并且其本底的ROS水平較高

14、,抗壞血酸,POCI及LBPC均能較模型組降低ROS水平,FFNT組及C36D組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與HaCaT細(xì)胞類似;在Caco-2細(xì)胞中,抗壞血酸,POCI及LBPC均能較模型組降低ROS水平。LBPC組的ROS水平普遍高于POCI及抗壞血酸組。
　　3.2、SOD結(jié)果
　　添加抗壞血酸,POCI及LBPC物質(zhì)能夠幫助HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞升高胞內(nèi)SOD水平,從而達(dá)到清除ROS,拮抗氧化損傷的目的,而FFNT及C

15、36D不能升高上述兩種細(xì)胞內(nèi)SOD水平。Caco-2細(xì)胞的本底SOD值較高,但其添加物質(zhì)組的SOD水平變化趨勢與其余細(xì)胞一致。
　　3.3、細(xì)胞凋亡結(jié)果
　　三種細(xì)胞均顯示了氧化應(yīng)激對細(xì)胞凋亡的影響。兩種細(xì)胞系的模型組,早期凋亡的細(xì)胞所占比例較大,而原代細(xì)胞中,中、晚期凋亡的比例大于早期凋亡的細(xì)胞;在其余組別中,存活細(xì)胞占絕對多數(shù),凋亡各期細(xì)胞比例較小。三種細(xì)胞中所添加的抗壞血酸,POCI及LBPC均能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生;F

16、FNT組及C36D組導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞中、晚期凋亡細(xì)胞所占比例較高,較模型組比例更高。FFNT及C36D由于有抑制成纖維細(xì)胞的作用,故而原代人成纖維細(xì)胞的中晚期凋亡細(xì)胞所占比例為絕對多數(shù),與HaCaT細(xì)胞存在一定差異。
　　3.4、細(xì)胞周期結(jié)果
　　模型組中,三種細(xì)胞均發(fā)生了G0/G1期阻滯,其中以兩種皮膚細(xì)胞的阻滯最為明顯。Caco-2細(xì)胞的模型組,與同種細(xì)胞其余各組G0/G1期細(xì)胞相比,差異不大,但G2

17、期明顯降低。在添加抗壞血酸,POCI及LBPC組,三種細(xì)胞的各周期指標(biāo)與空白對照組接近;而FFNT及C36D對紫外誘導(dǎo)后HaCaT細(xì)胞及原代人成纖維細(xì)胞的各周期指標(biāo)影響不大,與模型組差異不大。
　　研究結(jié)論：
　　1.本研究根據(jù)不同應(yīng)激源的損傷機(jī)制,分別建立了紫外線損傷角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和三維皮膚替代物的氧化應(yīng)激模型,建立了過氧化氫損傷腸上皮的氧化應(yīng)激模型。結(jié)果表明在IC20的紫外線劑量下和化合物暴露劑量下可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的

18、氧化應(yīng)激模型,用于抗氧化劑的篩選。
　　2.本研究根據(jù)篩查物的預(yù)期用途檢測了4種不同化合物,結(jié)果提示:在紫外線誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模式下,可以使用HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞對物質(zhì)進(jìn)行抗氧化劑篩檢,使用4種指標(biāo)能夠綜合判斷物質(zhì)的抗氧化特性,而僅使用ROS水平及周期指標(biāo)也可以初步判斷物質(zhì)是否具有抗氧化屬性。在H2O2應(yīng)激模式下,由于氧化應(yīng)激通路的差異,提示采用ROS、SOD水平及凋亡指標(biāo)可初步判斷物質(zhì)是否具有抗氧化特性。