基于固相增菌法和納米生物傳感技術(shù)的沙門(mén)氏菌可視化高效檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、目的：食源性致病菌（尤其是沙門(mén)氏菌）是公共衛(wèi)生的嚴(yán)重危害。全球食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)（Global Salm-Surv，GSS）估算每年有9,400萬(wàn)非傷寒沙門(mén)氏菌感染者，并引發(fā)155,000人死亡。由于現(xiàn)有檢測(cè)和分離技術(shù)的靈敏度不足，更多野生株并沒(méi)有被充分檢出，導(dǎo)致公眾的實(shí)際感染率遠(yuǎn)大于當(dāng)前的檢出報(bào)道。沙門(mén)氏菌等食源性致病菌的感染劑量通常很低，目前亟待研制出更高靈敏度、檢出率及分離率的適宜技術(shù)。雖然關(guān)于“一步法”和“快速檢測(cè)法”的技術(shù)革新層

2、出不窮，最大的技術(shù)需求仍要圍繞實(shí)現(xiàn)靶向菌的分離，這將直接影響后續(xù)病原學(xué)診斷、分子流行病學(xué)分析和藥敏檢測(cè)的開(kāi)展。實(shí)際上，真正有效的檢測(cè)、分離技術(shù)應(yīng)該基于充分的采樣和增菌策略，并配合新穎的超敏生物技術(shù)（例如生物傳感技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)、納米技術(shù)）。此前，應(yīng)用熒光納米生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)和原位分離細(xì)菌一直是個(gè)難題。本研究則擬設(shè)計(jì)一種新穎的基于特制纖維拭子固相增菌系統(tǒng)的熒光納米生物檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)沙門(mén)氏菌的高效檢測(cè)和可視化分離，并期望進(jìn)一步研制

3、出更簡(jiǎn)便和低成本的固相增菌檢測(cè)技術(shù)，以滿(mǎn)足公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中大樣本量沙門(mén)氏菌篩查工作的需求。
　　方法：
　　1.沙門(mén)氏菌固相增菌法的建立
　　(1)拭子及應(yīng)用培養(yǎng)基的研制：根據(jù)產(chǎn)硫化氫反應(yīng)特性，本研究設(shè)計(jì)了能在拭子上將其轉(zhuǎn)化成硫化亞鐵黑色沉淀物的培養(yǎng)基反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)拭子上的沙門(mén)氏菌菌落示蹤。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Central Compo

4、site Design，CCD）優(yōu)化研究方案中的培養(yǎng)基示蹤反應(yīng)體系的成分。在優(yōu)化研究中，以分屬不同血清群（A～F群）的9株標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌株和不同血清型的40株地方菌株為代表樣本各形成一個(gè)二階多項(xiàng)式模型。
　　(2)方法學(xué)評(píng)估：根據(jù)美國(guó)微生物學(xué)會(huì)（American Society for Microbiology，ASM）的Cumitechs指南(Cumulative Techniques and Proceduresin Clini

5、cal Microbiology)，配制含沙門(mén)氏菌(101cells ml-1)和大腸桿菌(104cells ml-1、105cells ml-1、106cells ml-1、107cells ml-1)的模擬菌液，形成不同的實(shí)驗(yàn)組（每組40份），計(jì)算最低檢出限、靈敏度、假陰性率、特異性及假陽(yáng)性率等指標(biāo)。由多家疾控中心共采集668份健康體檢人群的肛拭樣本，比較本研究方法與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法的陽(yáng)性檢出率差異。
　　2.基于固相增菌法和納米

6、生物傳感技術(shù)的沙門(mén)氏菌可視化高效檢測(cè)技術(shù)
　　(1)抗體制備：用分屬不同血清群的8株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別免疫2只SPF級(jí)日本大耳實(shí)驗(yàn)兔（共16只），提取并純化抗體供實(shí)驗(yàn)研究階段用。
　　(2)探針標(biāo)記：采用雙功能交聯(lián)劑法，合成抗體螯合的水溶性氨基功能化（CdSe/ZnS）量子點(diǎn)探針，并檢測(cè)其表征及濃度等。
　　(3)光學(xué)觀測(cè)儀器及檢測(cè)流程的研制：應(yīng)用InGaN材料制作的156個(gè)藍(lán)色發(fā)光二極管（激發(fā)波長(zhǎng)為405nm）制成環(huán)形激發(fā)

7、光源，配置10瓦的調(diào)諧器（輸入電壓:90V～264V，輸出電壓：12V）。此外，配套制作濾光片（國(guó)標(biāo)編號(hào)：ZWB2），其大小恰好可緊扣于環(huán)形激發(fā)光源的正面，使波長(zhǎng)400～680nm之間的激發(fā)光和其它干涉光得到截止。將濾光片與激發(fā)光源的組合體設(shè)法加裝于體視顯微鏡的目鏡上，構(gòu)建適合于人工觀測(cè)熒光及相關(guān)操作的儀器。配合探針及儀器的應(yīng)用，開(kāi)展檢測(cè)及分離技術(shù)流程的探索。
　　(4)表征的檢測(cè)：應(yīng)用透射電子顯微鏡（Transmission e

8、lectron microscopy，TEM）檢測(cè)拭子纖維上生長(zhǎng)的沙門(mén)氏菌菌體表面與量子點(diǎn)顆粒相互關(guān)系的表征狀態(tài)。由紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)量子點(diǎn)標(biāo)記前后的紫外吸收光譜，并由熒光分光光度計(jì)檢測(cè)相關(guān)熒光光譜。應(yīng)用型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡評(píng)估拭子纖維上的沙門(mén)氏菌與探針間的生物構(gòu)象和相互作用關(guān)系。
　　(5)方法學(xué)評(píng)估：根據(jù)美國(guó)微生物學(xué)會(huì)的Cumitechs方法學(xué)評(píng)價(jià)指南，配制含101cells ml-1沙門(mén)氏菌和105cells ml-1

9、、106cells ml-1、107cells ml-1非沙門(mén)氏菌（大腸桿菌/變形桿菌/檸檬酸桿菌）的模擬菌液（每40份樣本為一組），計(jì)算其最低檢出限。由疾控體檢中心采集120份健康體檢人群（未感染沙門(mén)菌）的肛拭液，再將定量的鼠傷寒沙門(mén)氏菌（101cells ml-1）相應(yīng)地加入模擬陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)組，以檢測(cè)靈敏度、特異性、檢出率及工作效率等指標(biāo)。
　　3.基于固相薄膜增菌法的高效篩查和分離沙門(mén)氏菌的可視化檢測(cè)技術(shù)
　　(1)固相

10、增菌用薄膜、簡(jiǎn)易紫外 LED光源及本章相應(yīng)的沙門(mén)氏菌可視化檢測(cè)技術(shù)的研制。兩種應(yīng)用于固相薄膜上的生化顯色功能化反應(yīng)被研制。一種是基于沙門(mén)氏菌還原硫離子的特性；而另一種源于沙門(mén)氏菌特異性產(chǎn)生的C8辛脂酶可分解底物4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試劑，分解轉(zhuǎn)化成的4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4-MU）可產(chǎn)生肉眼可視的熒光（λex=365nm，λem=450nm）。
　　(2)方法學(xué)評(píng)估：應(yīng)用115株標(biāo)準(zhǔn)

11、或地方菌株，進(jìn)行菌種特異性鑒定。由疾控中心共采集1304份健康從業(yè)人員的肛拭樣本，其中80份加入定量101cells ml-1的傷寒沙門(mén)氏菌（ATCC14028），用于檢測(cè)方法的特異性；余下1,224例新鮮肛拭樣本則被用于比較本檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法的檢出率等實(shí)用性能。
　　結(jié)果：
　　1.沙門(mén)氏菌固相增菌法的建立
　　(1).拭子及應(yīng)用培養(yǎng)基的研制：拭子由0.11g醫(yī)用級(jí)100％脫脂棉纖維及14.5cm長(zhǎng)的竹柄構(gòu)成，能飽

12、和吸取600μl培養(yǎng)基或樣本液。培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方含“40μl10%多價(jià)胨、40μl10%緩沖胨水、8μl1%脫氧膽酸鈉及0.01μg高分子超速吸水樹(shù)脂（Super-speed Super Absorbing Polymer，SSAP）”。設(shè)計(jì)的示蹤反應(yīng)體系三大變量被確定為“10%檸檬酸鐵銨6μl，20%硫代硫酸鈉6μl，5%胱氨酸6μl”。以20％的碳酸鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2，并加入蒸餾水補(bǔ)至600μl總體積。RSM構(gòu)建的Y1模型P1<0.

13、0001、Y2模型P2=0.0002，均說(shuō)明模型和優(yōu)化方案有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（醫(yī)用脫脂棉纖維材料的最新行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：YY/T0330-2015）。
　　(2).方法學(xué)評(píng)估：當(dāng)背景干擾菌（大腸桿菌）的濃度為105cells ml-1時(shí)，本研究方法的沙門(mén)氏菌最低檢出限為101cells ml-1。根據(jù)美國(guó)微生物學(xué)會(huì)的Cumitechs方法學(xué)評(píng)價(jià)指南，本研究方法的靈敏度為98.75%，假陰性率為1.25%；在含大腸桿菌（105cells ml-

14、1）的模擬樣本組中，本章方法的特異性為100%，假陽(yáng)性率則為0.0%。在668份健康體檢人群的肛拭樣本的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)檢測(cè)法的陽(yáng)性檢出率為為0.45%；而本法為2.10%，且24h內(nèi)產(chǎn)黑斑率為67.66%（452/668）。
　　2.基于固相增菌法和納米生物傳感技術(shù)的沙門(mén)氏菌可視化高效檢測(cè)技術(shù)
　　(1)抗體制備：所采集抗血清的效價(jià)均大于1：2048，后經(jīng)蛋白層析法純化得到的各（A～F血清群）抗體濃度分別為1.38mg/m

15、l、1.42mg/ml、1.58mg/ml、1.07mg/ml、1.52mg/ml、0.78mg/ml、1.58mg/ml、1.34mg/ml。肥達(dá)氏檢測(cè)顯示相應(yīng)抗體對(duì)傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌及乙型副傷寒桿菌的凝集價(jià)介于1:2048～1:4096。
　　(2)探針標(biāo)記和評(píng)估：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試，單克隆抗體成功修飾量子點(diǎn)形成生物探針，且標(biāo)記后純化探針的濃度可達(dá)到98.6×10?2μg/μl。經(jīng)透射電鏡檢測(cè)，探針的免疫學(xué)特異性被證實(shí)

16、。經(jīng)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，探針的發(fā)射光譜最大波長(zhǎng)在526nm，其與標(biāo)記前的524nm波長(zhǎng)非常接近，說(shuō)明所采用探針標(biāo)記方案對(duì)量子點(diǎn)性狀的影響很小。
　　(3)本研究方法及人工熒光觀測(cè)儀被成功地研制。掃描電鏡檢測(cè)也確證了探針的特異性免疫反應(yīng)性狀。
　　(4)方法學(xué)評(píng)估：當(dāng)背景干擾菌（大腸桿菌/變形桿菌/檸檬酸桿菌）的濃度達(dá)到105cells ml-1時(shí)，本法的沙門(mén)氏菌最低檢出限應(yīng)為101cells ml-1。在加標(biāo)（含101cel

17、ls ml-1鼠傷寒沙門(mén)氏菌）模擬樣本中，本方法的陽(yáng)性檢出率為96.67%，而傳統(tǒng)方法為91.67%。其中，硫化氫反應(yīng)產(chǎn)黑斑率為100%，肉眼可識(shí)別熒光率為68.33%。在不加標(biāo)模擬樣本中，本研究方法的產(chǎn)黑斑率為25.00%（30/120），產(chǎn)熒光率(假陽(yáng)性率)為1.67%（2/120）。在圍繞硫化氫反應(yīng)設(shè)計(jì)的篩選作用下，本研究方法的后續(xù)工作量被減少到25%（30/120）。在模擬樣本中，本方法的特異性可達(dá)98.33%（118/120）

18、。
　　3.基于固相薄膜增菌法的高效篩查和分離沙門(mén)氏菌的可視化檢測(cè)技術(shù)
　　(1)應(yīng)用三號(hào)層析濾紙薄膜成功制作含培養(yǎng)基的固相薄膜，每份紙片的尺寸可剛好飽和吸收1.0ml培養(yǎng)液。經(jīng)過(guò)研制，基于沙門(mén)氏菌產(chǎn)硫化氫反應(yīng)及MUCAP特異反應(yīng)的固相薄膜增菌法被確定。（相關(guān)化學(xué)分析濾紙材料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB/T1914-2007）。
　　(2)方法學(xué)評(píng)估：在115株菌的驗(yàn)證試驗(yàn)中，此可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌技術(shù)的菌種特異性為94.78%(

19、109/115)。在濃度為105cells ml-1的大腸桿菌背景下，本章研究方法的沙門(mén)氏菌最低檢出限可達(dá)101cells ml-1。在80份加標(biāo)（101cells ml-1的傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028）肛拭樣本中，兩步生化顯色反應(yīng)的陽(yáng)性率均為100%。在肛拭樣本的應(yīng)用驗(yàn)證中，本研究方法的整體陽(yáng)性檢出率為2.45%（30/1224），而傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法為0.49%（6/1224）；雙陽(yáng)性反應(yīng)的樣本率為37.25%（456/1224）；產(chǎn)

20、硫化氫陽(yáng)性且MUCAP陰性的單陽(yáng)性樣本率為17.40%（213/1224）。換言之，全部樣本經(jīng)篩查僅456份需要按照標(biāo)準(zhǔn)流程作后續(xù)分離鑒定。
　　結(jié)論：一種特異、高效、靈敏的可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的免疫傳感技術(shù)和一種新穎、簡(jiǎn)便、低成本的可視化固相薄膜增菌檢測(cè)法同時(shí)被建立。這些方法都可成為公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)和篩查大樣本中沙門(mén)氏菌的有利工具。實(shí)際上，高效獲取靶向菌的分離株是本技術(shù)的最大目的和優(yōu)勢(shì)，這將有助于進(jìn)一步開(kāi)展公共監(jiān)測(cè)領(lǐng)域（如食物中毒和水