基于固相增菌法和納米生物傳感技術(shù)的沙門氏菌可視化高效檢測技術(shù)的研究.pdf

1、目的：食源性致病菌（尤其是沙門氏菌）是公共衛(wèi)生的嚴重危害。全球食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)（Global Salm-Surv，GSS）估算每年有9,400萬非傷寒沙門氏菌感染者，并引發(fā)155,000人死亡。由于現(xiàn)有檢測和分離技術(shù)的靈敏度不足，更多野生株并沒有被充分檢出，導(dǎo)致公眾的實際感染率遠大于當前的檢出報道。沙門氏菌等食源性致病菌的感染劑量通常很低，目前亟待研制出更高靈敏度、檢出率及分離率的適宜技術(shù)。雖然關(guān)于“一步法”和“快速檢測法”的技術(shù)革新層

2、出不窮，最大的技術(shù)需求仍要圍繞實現(xiàn)靶向菌的分離，這將直接影響后續(xù)病原學診斷、分子流行病學分析和藥敏檢測的開展。實際上，真正有效的檢測、分離技術(shù)應(yīng)該基于充分的采樣和增菌策略，并配合新穎的超敏生物技術(shù)（例如生物傳感技術(shù)、免疫檢測技術(shù)、納米技術(shù)）。此前，應(yīng)用熒光納米生物技術(shù)實現(xiàn)可視化檢測和原位分離細菌一直是個難題。本研究則擬設(shè)計一種新穎的基于特制纖維拭子固相增菌系統(tǒng)的熒光納米生物檢測技術(shù)，以實現(xiàn)沙門氏菌的高效檢測和可視化分離，并期望進一步研制

3、出更簡便和低成本的固相增菌檢測技術(shù)，以滿足公共衛(wèi)生監(jiān)測中大樣本量沙門氏菌篩查工作的需求。
　　方法：
　　1.沙門氏菌固相增菌法的建立
　　(1)拭子及應(yīng)用培養(yǎng)基的研制：根據(jù)產(chǎn)硫化氫反應(yīng)特性，本研究設(shè)計了能在拭子上將其轉(zhuǎn)化成硫化亞鐵黑色沉淀物的培養(yǎng)基反應(yīng)體系，實現(xiàn)拭子上的沙門氏菌菌落示蹤。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）的中心組合試驗設(shè)計（Central Compo

4、site Design，CCD）優(yōu)化研究方案中的培養(yǎng)基示蹤反應(yīng)體系的成分。在優(yōu)化研究中，以分屬不同血清群（A～F群）的9株標準沙門氏菌株和不同血清型的40株地方菌株為代表樣本各形成一個二階多項式模型。
　　(2)方法學評估：根據(jù)美國微生物學會（American Society for Microbiology，ASM）的Cumitechs指南(Cumulative Techniques and Proceduresin Clini

5、cal Microbiology)，配制含沙門氏菌(101cells ml-1)和大腸桿菌(104cells ml-1、105cells ml-1、106cells ml-1、107cells ml-1)的模擬菌液，形成不同的實驗組（每組40份），計算最低檢出限、靈敏度、假陰性率、特異性及假陽性率等指標。由多家疾控中心共采集668份健康體檢人群的肛拭樣本，比較本研究方法與傳統(tǒng)標準方法的陽性檢出率差異。
　　2.基于固相增菌法和納米

6、生物傳感技術(shù)的沙門氏菌可視化高效檢測技術(shù)
　　(1)抗體制備：用分屬不同血清群的8株標準菌株分別免疫2只SPF級日本大耳實驗兔（共16只），提取并純化抗體供實驗研究階段用。
　　(2)探針標記：采用雙功能交聯(lián)劑法，合成抗體螯合的水溶性氨基功能化（CdSe/ZnS）量子點探針，并檢測其表征及濃度等。
　　(3)光學觀測儀器及檢測流程的研制：應(yīng)用InGaN材料制作的156個藍色發(fā)光二極管（激發(fā)波長為405nm）制成環(huán)形激發(fā)

7、光源，配置10瓦的調(diào)諧器（輸入電壓:90V～264V，輸出電壓：12V）。此外，配套制作濾光片（國標編號：ZWB2），其大小恰好可緊扣于環(huán)形激發(fā)光源的正面，使波長400～680nm之間的激發(fā)光和其它干涉光得到截止。將濾光片與激發(fā)光源的組合體設(shè)法加裝于體視顯微鏡的目鏡上，構(gòu)建適合于人工觀測熒光及相關(guān)操作的儀器。配合探針及儀器的應(yīng)用，開展檢測及分離技術(shù)流程的探索。
　　(4)表征的檢測：應(yīng)用透射電子顯微鏡（Transmission e

8、lectron microscopy，TEM）檢測拭子纖維上生長的沙門氏菌菌體表面與量子點顆粒相互關(guān)系的表征狀態(tài)。由紫外可見分光光度計檢測量子點標記前后的紫外吸收光譜，并由熒光分光光度計檢測相關(guān)熒光光譜。應(yīng)用型場發(fā)射掃描電子顯微鏡評估拭子纖維上的沙門氏菌與探針間的生物構(gòu)象和相互作用關(guān)系。
　　(5)方法學評估：根據(jù)美國微生物學會的Cumitechs方法學評價指南，配制含101cells ml-1沙門氏菌和105cells ml-1

9、、106cells ml-1、107cells ml-1非沙門氏菌（大腸桿菌/變形桿菌/檸檬酸桿菌）的模擬菌液（每40份樣本為一組），計算其最低檢出限。由疾控體檢中心采集120份健康體檢人群（未感染沙門菌）的肛拭液，再將定量的鼠傷寒沙門氏菌（101cells ml-1）相應(yīng)地加入模擬陽性的實驗組，以檢測靈敏度、特異性、檢出率及工作效率等指標。
　　3.基于固相薄膜增菌法的高效篩查和分離沙門氏菌的可視化檢測技術(shù)
　　(1)固相

10、增菌用薄膜、簡易紫外 LED光源及本章相應(yīng)的沙門氏菌可視化檢測技術(shù)的研制。兩種應(yīng)用于固相薄膜上的生化顯色功能化反應(yīng)被研制。一種是基于沙門氏菌還原硫離子的特性；而另一種源于沙門氏菌特異性產(chǎn)生的C8辛脂酶可分解底物4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試劑，分解轉(zhuǎn)化成的4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4-MU）可產(chǎn)生肉眼可視的熒光（λex=365nm，λem=450nm）。
　　(2)方法學評估：應(yīng)用115株標準

11、或地方菌株，進行菌種特異性鑒定。由疾控中心共采集1304份健康從業(yè)人員的肛拭樣本，其中80份加入定量101cells ml-1的傷寒沙門氏菌（ATCC14028），用于檢測方法的特異性；余下1,224例新鮮肛拭樣本則被用于比較本檢測方法與傳統(tǒng)方法的檢出率等實用性能。
　　結(jié)果：
　　1.沙門氏菌固相增菌法的建立
　　(1).拭子及應(yīng)用培養(yǎng)基的研制：拭子由0.11g醫(yī)用級100％脫脂棉纖維及14.5cm長的竹柄構(gòu)成，能飽

12、和吸取600μl培養(yǎng)基或樣本液。培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方含“40μl10%多價胨、40μl10%緩沖胨水、8μl1%脫氧膽酸鈉及0.01μg高分子超速吸水樹脂（Super-speed Super Absorbing Polymer，SSAP）”。設(shè)計的示蹤反應(yīng)體系三大變量被確定為“10%檸檬酸鐵銨6μl，20%硫代硫酸鈉6μl，5%胱氨酸6μl”。以20％的碳酸鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2，并加入蒸餾水補至600μl總體積。RSM構(gòu)建的Y1模型P1<0.

13、0001、Y2模型P2=0.0002，均說明模型和優(yōu)化方案有統(tǒng)計學意義。（醫(yī)用脫脂棉纖維材料的最新行業(yè)標準：YY/T0330-2015）。
　　(2).方法學評估：當背景干擾菌（大腸桿菌）的濃度為105cells ml-1時，本研究方法的沙門氏菌最低檢出限為101cells ml-1。根據(jù)美國微生物學會的Cumitechs方法學評價指南，本研究方法的靈敏度為98.75%，假陰性率為1.25%；在含大腸桿菌（105cells ml-

14、1）的模擬樣本組中，本章方法的特異性為100%，假陽性率則為0.0%。在668份健康體檢人群的肛拭樣本的對比實驗中，傳統(tǒng)檢測法的陽性檢出率為為0.45%；而本法為2.10%，且24h內(nèi)產(chǎn)黑斑率為67.66%（452/668）。
　　2.基于固相增菌法和納米生物傳感技術(shù)的沙門氏菌可視化高效檢測技術(shù)
　　(1)抗體制備：所采集抗血清的效價均大于1：2048，后經(jīng)蛋白層析法純化得到的各（A～F血清群）抗體濃度分別為1.38mg/m

15、l、1.42mg/ml、1.58mg/ml、1.07mg/ml、1.52mg/ml、0.78mg/ml、1.58mg/ml、1.34mg/ml。肥達氏檢測顯示相應(yīng)抗體對傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌及乙型副傷寒桿菌的凝集價介于1:2048～1:4096。
　　(2)探針標記和評估：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測試，單克隆抗體成功修飾量子點形成生物探針，且標記后純化探針的濃度可達到98.6×10?2μg/μl。經(jīng)透射電鏡檢測，探針的免疫學特異性被證實

16、。經(jīng)熒光分光光度計檢測，探針的發(fā)射光譜最大波長在526nm，其與標記前的524nm波長非常接近，說明所采用探針標記方案對量子點性狀的影響很小。
　　(3)本研究方法及人工熒光觀測儀被成功地研制。掃描電鏡檢測也確證了探針的特異性免疫反應(yīng)性狀。
　　(4)方法學評估：當背景干擾菌（大腸桿菌/變形桿菌/檸檬酸桿菌）的濃度達到105cells ml-1時，本法的沙門氏菌最低檢出限應(yīng)為101cells ml-1。在加標（含101cel

17、ls ml-1鼠傷寒沙門氏菌）模擬樣本中，本方法的陽性檢出率為96.67%，而傳統(tǒng)方法為91.67%。其中，硫化氫反應(yīng)產(chǎn)黑斑率為100%，肉眼可識別熒光率為68.33%。在不加標模擬樣本中，本研究方法的產(chǎn)黑斑率為25.00%（30/120），產(chǎn)熒光率(假陽性率)為1.67%（2/120）。在圍繞硫化氫反應(yīng)設(shè)計的篩選作用下，本研究方法的后續(xù)工作量被減少到25%（30/120）。在模擬樣本中，本方法的特異性可達98.33%（118/120）

18、。
　　3.基于固相薄膜增菌法的高效篩查和分離沙門氏菌的可視化檢測技術(shù)
　　(1)應(yīng)用三號層析濾紙薄膜成功制作含培養(yǎng)基的固相薄膜，每份紙片的尺寸可剛好飽和吸收1.0ml培養(yǎng)液。經(jīng)過研制，基于沙門氏菌產(chǎn)硫化氫反應(yīng)及MUCAP特異反應(yīng)的固相薄膜增菌法被確定。（相關(guān)化學分析濾紙材料的國家標準號為GB/T1914-2007）。
　　(2)方法學評估：在115株菌的驗證試驗中，此可視化檢測沙門氏菌技術(shù)的菌種特異性為94.78%(

19、109/115)。在濃度為105cells ml-1的大腸桿菌背景下，本章研究方法的沙門氏菌最低檢出限可達101cells ml-1。在80份加標（101cells ml-1的傷寒沙門氏菌ATCC14028）肛拭樣本中，兩步生化顯色反應(yīng)的陽性率均為100%。在肛拭樣本的應(yīng)用驗證中，本研究方法的整體陽性檢出率為2.45%（30/1224），而傳統(tǒng)標準方法為0.49%（6/1224）；雙陽性反應(yīng)的樣本率為37.25%（456/1224）；產(chǎn)

20、硫化氫陽性且MUCAP陰性的單陽性樣本率為17.40%（213/1224）。換言之，全部樣本經(jīng)篩查僅456份需要按照標準流程作后續(xù)分離鑒定。
　　結(jié)論：一種特異、高效、靈敏的可視化檢測沙門氏菌的免疫傳感技術(shù)和一種新穎、簡便、低成本的可視化固相薄膜增菌檢測法同時被建立。這些方法都可成為公共衛(wèi)生監(jiān)測和篩查大樣本中沙門氏菌的有利工具。實際上，高效獲取靶向菌的分離株是本技術(shù)的最大目的和優(yōu)勢，這將有助于進一步開展公共監(jiān)測領(lǐng)域（如食物中毒和水