AGAP基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及體外抗HCC作用研究.pdf

1、目的：
　　 1.利用分子生物學(xué)技術(shù),以AFP基因順式作用元件(啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)作為調(diào)節(jié)因子,構(gòu)建肝細(xì)胞癌特異性鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(Analgesic-antitumor peptide,AGAP)基因真核表達(dá)載體,利用計(jì)算機(jī)輔助分析和預(yù)測(cè)所表達(dá)蛋白質(zhì)的理化和結(jié)構(gòu)特征。
　　 2.觀察AGAP基因真核表達(dá)載體體外抗肝細(xì)胞肝癌作用,探索生物毒素靶向抗肝細(xì)胞癌作用。
　　 方法：
　　 1.提取東亞鉗蝎總RNA,用

2、RT-PCR法擴(kuò)增出AGAP基因并電泳鑒定。
　　 2.擴(kuò)增含最短最有效AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組合真核表達(dá)載體pAFP,與目的基因雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,并經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定。
　　 3.應(yīng)用VectoR NTI軟件對(duì)pAFP-AGAP序列進(jìn)行讀框(Ore)分析,用www.expasy.org網(wǎng)站提供的ProtParam方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析,并將本實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒所表達(dá)的AGAP

3、蛋白與GeneBank中AGAP蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔性、親水性、抗原性、表位對(duì)比。
　　 4.利用脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,將pAFP-AGAP導(dǎo)入細(xì)胞中,并同時(shí)設(shè)對(duì)照組,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中AGAP mRNA的表達(dá),CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性作用并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.AGAP基因克隆成功,電泳大小與預(yù)期相符。
　　 2.構(gòu)建的AGAP基因真核表達(dá)載體pAFP-AGAP經(jīng)酶切、測(cè)序

4、證明構(gòu)建正確。
　　 3.通過(guò)生物信息學(xué)分析證實(shí)重組質(zhì)粒pAFP-AGAP所表達(dá)的目的蛋白,在二級(jí)結(jié)構(gòu)上沒(méi)有變化,親水性、抗原性等生物學(xué)活性也未受影響。
　　 4.AFP陽(yáng)性HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAFP-AGAP24 h后仍正常生長(zhǎng),48 h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)腫脹、懸浮,72 h時(shí)細(xì)胞已基本懸浮,胞質(zhì)中可見(jiàn)粗大顆粒和空泡；而AFP陰性HeLa細(xì)胞和L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后增殖正常,排列整齊。
　　 5.各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

5、pAFP-AGAP24 h、48 h和72 h后,僅AFP陽(yáng)性HepG2細(xì)胞有AGAP mRNA表達(dá),而AFP陰性的HeLa細(xì)胞和L02細(xì)胞均無(wú)AGAPmRNA表達(dá)
　　 6.AFP陽(yáng)性HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAFP-AGAP48 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pAFP的陰性對(duì)照組相比顯著受抑(P<0.01),24 h、48 h和72 h時(shí)抑制率分別為2.4％、44.4％和74.6％,抑制作用隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；而AFP陰性HeL