2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、趨化因子受體是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)超家族的成員之一。G蛋白偶聯(lián)受體是一類(lèi)重要的藥物靶點(diǎn),目前針對(duì)GPCR常用的檢測(cè)方法有放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及一些依賴(lài)于檢測(cè)G蛋白偶聯(lián)受體下游信號(hào)通路的功能性實(shí)驗(yàn)等。Ga16作為Gq家族的成員之一,在受體激活后,可以通過(guò)第二信使引起胞內(nèi)鈣離子的釋放。本課題基于共表達(dá)受體和Ga16蛋白、而測(cè)定胞內(nèi)鈣離子信號(hào),分別建立趨化因子受體CCR5和CXCR

2、4的調(diào)節(jié)劑的高通量篩選模型。 1.趨化因子受體CCR5鈣流篩選模型的建立和應(yīng)用,分為三個(gè)小部分. 第一部分,CHO/CCR5/Gαl6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立。 方法:電穿孔法將編碼CCR5和Gal6蛋白的基因?qū)隒HO細(xì)胞,利用抗性篩選20天左右挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至形成細(xì)胞株,RT-PCR檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:RT-PCR檢測(cè)到CCR5和Ga16的表達(dá),獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCR5和Gαl6的CHO/CCR5/

3、Gαl6細(xì)胞株。 第二部分,CHO/CCR5/Gαl6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株上CCR5活性的檢測(cè)。 方法:[35S]—GTPγs分別檢測(cè)CCR5的激動(dòng)劑RANTES和拮抗劑maraviroc對(duì)CCR5的作用。 結(jié)果:RANTES能呈劑量依賴(lài)性地激活CCR5,maraviroc能劑量依賴(lài)性地抑制RANTES對(duì)CCR5的激活。提示建立的CHO/CCR5/Gα16細(xì)胞株上CCR5具有很好的活性。 第三部分,鈣流篩選模型的建

4、立及應(yīng)用。 方法: (1)將建立的鈣流模型分為激動(dòng)劑和拮抗劑兩種模式,分別評(píng)價(jià)RANTES和maraviroc對(duì)受體的作用; (2)分別應(yīng)用這兩種模式檢測(cè)RANTES和maraviroc的劑量反應(yīng)性,獲得它們的EC50值或IC50值; (3)應(yīng)用拮抗劑模式評(píng)價(jià)CCR5拮抗劑先導(dǎo)化合物庫(kù)中的一系列化合物。 結(jié)果: (1)RANTES激活CCR5,在激動(dòng)劑模式中檢測(cè)到強(qiáng)烈的鈣流信號(hào),而在拮抗劑

5、模式中maraviroc抑制RANTES引起的鈣流反應(yīng); (2)鈣流模型獲得的RANTES的EC50值及maraviroc的IC50值與傳統(tǒng)篩選方法得到的結(jié)果具有很好的一致性,提示建立的鈣流模型可用于CCR5調(diào)節(jié)劑的高通量篩選; (3)獲得44個(gè)對(duì)CCR5有較強(qiáng)抑制作用的化合物,再用鈣流模型檢測(cè)它們的劑量反應(yīng)性,得到的IC50值與[35S]—GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果相當(dāng)且均接近于陽(yáng)性對(duì)照maraviroc。

6、2.趨化因子受體CXCR4鈣流篩選模型的建立,分為三個(gè)小部分. 第一部分,CHO/myc—CXCR4/Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立。 方法:電穿孔法將編碼myc—CXCR4和Gα16蛋白的基因?qū)隒HO細(xì)胞,利用抗性篩選20天左右挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至形成細(xì)胞株,免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)定位在細(xì)胞膜上的受體。 結(jié)果:在獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株上,免疫熒光染色檢測(cè)到CXCR4定位于細(xì)胞膜上。 第二部分,CHO/myc—CXC

7、R4/Gα16穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株上CXCR4活性的檢測(cè)。 方法:[35S]—GTPγS和鈣流實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCR4激動(dòng)劑SDF-1對(duì)CXCR4的作用。 結(jié)果:兩種實(shí)驗(yàn)上SDF-1都劑量依賴(lài)性地激活CXCR4,且兩種實(shí)驗(yàn)獲得的SDF-1的EC50值較為吻合。提示建立的CHO/myc—CXCR4/Gα16細(xì)胞株上CXCR4具有很好的活性。 第三部分,CHO/myc—CXCR4/Gα16細(xì)胞株上CXCR4內(nèi)吞、脫敏等信號(hào)通路相關(guān)事

8、件的探討。 方法: (1)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDF-1刺激后引起CXCR4的內(nèi)吞; (2)鈣流實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDF-1處理不同時(shí)間后CXCR4的脫敏情況; (3)Western blot檢測(cè)SDF-1處理不同時(shí)間后CXCR4總蛋白的表達(dá)量情況。 結(jié)果: (1)CXCR4受到SDF-1處理后內(nèi)吞到胞漿內(nèi); (2)SDF-1刺激5分鐘至24小時(shí),CXCR4均發(fā)生脫敏; (3)SDF

9、-1持續(xù)刺激CXCR4三個(gè)小時(shí),即可引起CXCR4表達(dá)量下調(diào)。 結(jié)論: 1.構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白趨化因子受體CCR5/CXCR4和Gα16的CHO/CCR5/Gα16和CHO/myc—CXCR4/Gα16細(xì)胞株,細(xì)胞株中CCR5和CXCR4具有較好的活性。 2.基于共表達(dá)受體和Gαl6蛋白建立了激動(dòng)劑和拮抗劑的兩種鈣流實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,這兩種模式能很好的區(qū)分不同配體對(duì)受體的激動(dòng)或拮抗作用。 3.應(yīng)用CCR5拮抗

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