以木聚糖酶基因?yàn)闃?biāo)記構(gòu)建枯草芽孢桿菌高效表達(dá)系統(tǒng).pdf

1、到目前為止，已有多種基因被鑒定和克隆，他們表達(dá)的蛋白產(chǎn)物不論是對(duì)于理論研究還是實(shí)際應(yīng)用都具有重要的價(jià)值。因此基因表達(dá)系統(tǒng)的需求也與日俱增。各種蛋白一般在大腸桿菌宿主中成功表達(dá)，但大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)仍然存在一些缺陷，比如具有致病性、含有內(nèi)毒素(脂多糖)、蛋白質(zhì)分泌在胞內(nèi)形成包含體?？莶菅堪麠U菌(Bacillus subtilis)是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)外源蛋白較理想的宿主，近幾年已在枯草芽胞桿菌中成

2、功表達(dá)了多種基因，但大多都應(yīng)用來源于金黃色葡萄球菌、乳酸桿菌等的載體來表達(dá)外源基因，由于其在枯草芽胞桿菌中存在分離復(fù)制的不穩(wěn)定及外源基因的克隆表達(dá)效率低的現(xiàn)象，故都不是枯草芽胞桿菌的最佳選擇，還有待改進(jìn)。由此發(fā)展起來了整合載體，將外源目的基因整合到染色體上復(fù)制表達(dá)是解決染色體外復(fù)制質(zhì)粒在宿主中遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象的有效的替代方法。當(dāng)然，一套好的表達(dá)系統(tǒng)不僅要能分泌蛋白質(zhì)，保持遺傳和分裂的穩(wěn)定性，還應(yīng)該有一些高效表達(dá)的元件(例如具有強(qiáng)啟動(dòng)子等)

3、。 本研究以木聚糖酶基因(xynA)為研究對(duì)象，構(gòu)建了枯草芽胞桿菌中穩(wěn)定的高效表達(dá)系統(tǒng)。具體方法是采用PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室分離的芽胞桿菌基因組DNA中分別擴(kuò)增出完整木聚糖酶基因和不帶啟動(dòng)子部分的木聚糖酶基因；利用蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)的強(qiáng)啟動(dòng)子，即S.層蛋白的啟動(dòng)子，通過重疊延伸PCR法(SOE-PCR)連接到xynA基因上得到重組基因S-xynA，將xynA和S-xynA分別裝載到整合載

4、體pDG1730上，轉(zhuǎn)化α-淀粉酶高產(chǎn)菌株枯草芽胞桿菌B47。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能有效分泌到胞外且具有正常的生物學(xué)活性。在搖瓶發(fā)酵過程中，利用自身啟動(dòng)子表達(dá)重組菌的木聚糖酶活在48h時(shí)達(dá)到50.1 IU/mL，而利用S-層蛋白啟動(dòng)子表達(dá)的木聚糖酶的產(chǎn)量在48h達(dá)到84.9 IU/mL，是利用自身啟動(dòng)子表達(dá)的木聚糖酶活的1.69倍。SDS-PAGE分析表明，該木聚糖酶的的分子量為26kD。 對(duì)該重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基