E3鏈接酶Hrd1及對Optineurin的質(zhì)量控制機制研究.pdf

1、目的：研究Optineurin（OPTN）及其兩種疾病相關(guān)突變體在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量控制的不同，從細胞分子生物學水平揭示其引起不同疾病的可能機制。
　　方法：為了明確OPTN及其突變體在細胞內(nèi)的降解代謝：在HEK293細胞內(nèi)分別過表達三種OPTN蛋白，加入125μg/ml的環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，CHX），不同時間點收集細胞進行裂解，Western blot檢測三種蛋白的蛋白水平，確定三種OPTN是否降解及其速率；加入

2、泛素蛋白酶體抑制劑MG132或者自噬抑制劑Bafi，收集細胞進行裂解，Western blot檢測三種蛋白的蛋白水平，明確其降解通路；加入CHX和MG132或CHX和Bafi，不同時間點收集細胞進行裂解，Western blot檢測三種蛋白的蛋白水平，進一步確認其降解途徑。篩選并明確介導 OPTN降解的介質(zhì)：HEK293細胞中分別共表達 GFP-WT-OPTN和 FLAG或 FLAG-Hrd1或myc-trim5或FLAG-RNF6或F

3、LAG-trim8或FLAG-trim26，收集細胞進行裂解，檢測WT-OPTN的蛋白水平；在 HEK293細胞中分別共表達 GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN或GFP-E478G-OPTN和FLAG-Hrd1，收集細胞裂解，檢測三種OPTN蛋白水平的變化；在HEK293細胞中敲除E3鏈接酶Hrd148 h，再過表達GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN，加入或者不加入MG132處理，收集細胞裂解，并檢測這兩

4、種蛋白水平的變化；PCR方法亞克隆突變E3鏈接酶Hrd1的功能位點ring finger，HEK293細胞中分別共表達三種OPTN蛋白和FLAG或FLAG-Hrd1或FLAG-Hrd1△ring finger，免疫熒光檢測其共定位情況；HEK293細胞中分別共表達 GFP-N3和 FLAG-Hrd1或者 GFP-WT-OPTN和 FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG，免疫共沉淀檢測GFP-WT-OPTN和FLAG-Hr

5、d1的結(jié)合情況。探討E3鏈接酶Hrd1促進三種OPTN形成聚集的機制：HEK293細胞中分別共表達FLAG-Hrd1和三種蛋白，γ-tubulin的標記微管組織中心，免疫熒光確定聚集和微管組織中心的關(guān)系；HEK293細胞共表達GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1，分別加入MG132、MG132和微管解聚藥Nocodazole、MG132和HDAC抑制劑TSA或者MG132和dynein抑制劑EHNA進行處理，α-tubulin標記

6、微管結(jié)構(gòu)，免疫熒光檢測聚集形態(tài)與微管改變的關(guān)系；小RNA干擾技術(shù)敲除HEK293細胞中的Hrd1，48 h后過表達GFP-WT-OPTN，加入或者不加入MG132進行處理，γ-tubulin標記微管組織中心，免疫熒光觀察顆粒分布與微管組織中心的關(guān)系。
　　結(jié)果：HEK293細胞分別過表達三種蛋白，加入CHX后收集的蛋白水平提示，GFP-E50K-OPTN降解速率最快，其次為GFP-WT-OPTN，GFP-WE478G-OPTN穩(wěn)定

7、而不易降解；加入泛素蛋白酶體抑制劑MG132或者自噬抑制劑Bafi，收集細胞蛋白檢測顯示，GFP-WT-OPTN和GFP-E50K-OPTN主要經(jīng)過泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解，GFP-E478G-OPTN穩(wěn)定而不易降解；MG132可延緩泛素蛋白酶體系統(tǒng)對WT-OPTN和E50K-OPTN的降解。HEK293細胞中分別共表達GFP-WT-OPTN和FLAG或E3鏈接酶（FLAG-Hrd1或myc-trim5或FLAG-RNF6或FLAG-tri

8、m8或FLAG-trim26），結(jié)果顯示，E3鏈接酶 Hrd1可介導 GFP-WT-OPTN的降解；在HEK293細胞中分別共表達 GFP-WT-OPTN或 GFP-E50K-OPTN或GFP-E478G-OPTN和 FLAG-Hrd1，蛋白水平的變化表明，E3鏈接酶 Hrd1介導WT-OPTN和E50K-OPTN的降解；在HEK293細胞中敲除E3鏈接酶Hrd1后再過表達GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN，并檢測這兩種

9、蛋白水平的變化，結(jié)果表明缺失E3鏈接酶Hrd1時，WT-OPTN和E50K-OPTN降解抑制，而MG132可放大該效應(yīng)；HEK293細胞中分別共表達三種OPTN蛋白和FLAG或FLAG-Hrd1或FLAG-Hrd1△ring finger，免疫熒光檢測顯示，三種蛋白均與FLAG-Hrd1共定位，但是與FLAG-Hrd1△ring finger失去共定位功能；此外E3鏈接酶Hrd1使得WT-OPTN在核周形成較大聚集結(jié)構(gòu)，E50K-OPT

10、N在核周形成分散的聚集，E478G-OPTN在核周形成較小的聚集結(jié)構(gòu)；HEK293細胞中分別共表達GFP-N3和FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG，免疫共沉淀檢測顯示GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1結(jié)合，并泛素化增強。HEK293細胞中分別共表達FLAG-Hrd1和三種蛋白，免疫熒光發(fā)現(xiàn)聚集結(jié)構(gòu)均與微管組織中心共定位；HEK293細胞共表達GFP-WT-OPTN

11、和FLAG-Hrd1，分別加入MG132、MG132和微管解聚藥Nocodazole、MG132和HDAC抑制劑TSA或者MG132和dynein抑制劑EHNA進行處理，免疫熒光檢測提示Nocodazole、TSA和EHNA導致WT-OPTN無法聚集；小RNA干擾技術(shù)敲除HEK293細胞中的E3鏈接酶Hrd1，48 h后過表達GFP-WT-OPTN，加入或者不加入MG132進行處理，免疫熒光觀察到MG132處理后，E3鏈接酶Hrd1的缺