E3泛素連接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫應答中的調(diào)控及機制研究.pdf

1、固有免疫應答是機體防御病原入侵的第一道防線。固有免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞(DCs)等抗原提呈細胞通過其表面模式識別受體（PRRs）檢測微生物分子成分—病原相關分子模式(PAMPs)，PRRs也能夠識別來源于損傷組織和壞死細胞的免疫刺激產(chǎn)物，也稱作(DAMPs)。
　　病毒感染時能夠誘導機體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，這一過程依賴于免疫細胞的PRRs對病毒成分的識別。TLRs識別相應PAMPs后，能夠活化一系列胞內(nèi)信號分子，最終導致依賴于

2、核因子κB(NF-κB)的促炎細胞因子的產(chǎn)生以及依賴于干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。維甲酸誘導的基因Ⅰ樣受體(RLRs)是存在于細胞質(zhì)中的一類RNA解旋酶，主要負責dsRNA病毒的識別。RLRs包括RIG-Ⅰ和MDA5，通過與病毒的相互作用促進IRF的活化與核轉位，誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。水泡口炎病毒(VSV)能夠活化TLRs和RLRs。Ⅰ型干擾素可促進200多種抗病毒基因的轉錄，在病毒感染的多個階段發(fā)揮干預作用，并且能夠提高

3、細胞毒NK細胞和CD8+T細胞對感染細胞的敏感性，抵御病毒感染。
　　泛素化(ubiquitination)是一種普遍存在的蛋白質(zhì)轉錄后修飾方式，可涉及眾多生物學過程。信號蛋白的泛素化修飾在固有免疫應答中至關重要。泛素化是一個涉及3種酶的級聯(lián)反應:E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶(E3s)。泛素化過程對底物的特異性識別主要依賴于E3s。E3s主要分為兩類:HECT E3s和RING E3s。E3s參與免疫應答眾多信號

4、通路的調(diào)節(jié)，例如，E3泛素連接酶RNF125對RIG-I進行K48泛素化修飾介導RIG-Ⅰ在蛋白酶體的降解，負向調(diào)控RIG-I信號通路;A20作為一個去泛素化的E3泛素連接酶，在病毒感染過程中可以靶向調(diào)節(jié)NF-κB和IRF信號通路。
　　NEDD4L是E3泛素連接酶NEDD4家族成員，屬于HECT E3s。已有報道NEDD4L能夠泛素化修飾上皮細胞鈉離子通道，是機體維持正常血壓的關鍵調(diào)控者，NEDD4L的突變與高血壓等心血管疾病的

5、發(fā)生密切相關;NEDD4L與許多腫瘤相關:在結腸癌中，NEDD4L可抑制經(jīng)典的Wnt信號通路發(fā)揮抑癌作用;NEDD4L可泛素化降解Smad2，負向調(diào)控TGFβ信號通路。NEDD4L也涉及到RNA病毒如HIV-1的出芽過程。
　　然而，到目前為止，尚未有NEDD4L在固有免疫應答中的相關報道。已知NEDD4家族中的NEDD4、ITCH能夠通過不同的方式調(diào)節(jié)免疫細胞的功能和固有免疫應答。NEDD4L作為一個與NEDD4高度同源，且表達

6、廣泛的E3泛素連接酶，是否參與抗病毒固有免疫應答的調(diào)控尚不清楚。
　　本課題分三部分對NEDD4L在抗病毒固有免疫應答中的調(diào)控以及其作用機制進行了研究。
　　一、NEDD4L對VSV誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的選擇性促進作用
　　在C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞中，我們發(fā)現(xiàn)VSV感染能夠上調(diào)NEDD4L的表達水平且具有時間依賴性。利用靶向干擾NEDD4L的siRNA抑制NEDD4L在巨噬細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲減能夠

7、抑制VSV誘導的IFN-β的產(chǎn)生，而對TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯影響。
　　通過將NEDD4L條件性敲除(CKO)小鼠和Lyz2cre小鼠雜交，培育出NEDD4L髓系基因敲除小鼠（NEDD4Lfl/flLyz2cre+）和同窩野生型對照小鼠（NEDD4Lfl/flLyz2cre-）。經(jīng)免疫印跡分析NEDD4L的敲除效率，發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔巨噬細胞中NEDD4L的表達水平降低70％以上，在骨髓巨噬細胞中NEDD4L表達量降低80％

8、以上。我們觀察到NEDD4L的缺失不影響小鼠的生長發(fā)育，并且經(jīng)流式細胞術分析了小鼠脾臟、骨髓、外周血中免疫細胞種類與數(shù)量，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的敲除并不影響小鼠免疫細胞的分化發(fā)育。
　　在體外利用VSV感染NEDD4Lfl/flLyz2cre-和NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠的腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了VSV誘導的IFN-β的產(chǎn)生，而促炎細胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生無明顯差異。
　　以上研究

9、結果說明VSV感染時，NEDD4L能夠促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，但不影響促炎細胞因子的生成。
　　二、NEDD4L調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機制研究
　　根據(jù)第一部分得到的結果，我們首先檢測了NEDD4L對VSV感染所活化的信號通路的影響。在不同時間點利用VSV感染NEDD4Lfl/flLyz2cre-和NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠巨噬細胞，通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)NEDD4L的缺失顯著抑制了TBK1和IRF3的活化，但不影

10、響MAPKs中JNK、ERK和P38以及NF-κB中P65的活化，提示NEDD4L作用于TBK1的上游，促進下游信號的活化。
　　我們進一步研究了NEDD4L作用的分子機制。在病毒感染激活的信號通路中，泛素連接酶TRAF3位于TBK1的上游，可發(fā)生泛素化修飾調(diào)控RLRs、TLRs信號，是調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的關鍵信號蛋白。通過分析NEDD4L的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)NEDD4L具有多個TRAF結合位點。因此我們猜測，NEDD4L或許是通過與

11、TRAF3相互作用促進了下游信號分子TBK1和IRF3的活化。為了進一步驗證，我們利用VSV感染小鼠腹腔巨噬細胞以激活NEDD4L參與的信號通路，通過免疫共沉淀實驗確定NEDD4L能夠與TRAF3相互結合。
　　為了進一步尋找NEDD4L與TRAF3相互結合的結構域，我們根據(jù)NEDD4L分子結構特點構建了其不同結構域缺失的突變體:分別為N．末端C2結構域缺失突變體(NEDD4L-δC2)，C-末端HECT結構域缺失突變體(NEDD

12、4L-δHECT)，C2及WW結構域缺失突變體(NEDD4L-δCW)以及位于HECT結構域中的943位半胱氨酸殘基突變體(NEDD4L-C943A)。我們將NEDD4L及其不同突變體的表達質(zhì)粒與TRAF3共轉染于HEK293T細胞，經(jīng)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)C2及WW結構域的缺失(NEDD4L-δCW)會阻礙NEDD4L與TRAF3的結合，而C2結構域的缺失(NEDD4L-δC2)并不影響其與TRAF3的結合，說明WW結構域是二者相互結合的必要

13、結構域。
　　我們繼而檢測了二者的相互作用方式。NEDD4L作為E3泛素連接酶，能夠特異性識別底物并對其進行泛素化修飾發(fā)揮功能。TRAF3能夠發(fā)生泛素化修飾參與信號強弱的調(diào)控。因此，我們首先檢測了NEDD4L對TRAF3泛素化水平的影響。我們在HEK293T細胞中共轉染NEDD4L、TRAF3和泛素(Ubiquitin，Ub)的表達質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)NEDD4L可明顯促進TRAF3的泛素化。我們進一步尋找了NEDD4L對TRAF3泛素化修

14、飾的必要功能域，通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，HECT結構域缺失(NEDD4L-δHECT)顯著抑制了NEDD4L對TRAF3的泛素化，說明NEDD4L是通過HECT結構域泛素化修飾TRAF3。C2結構域缺失(NEDD4L-δC2)顯著促進了TRAF3的泛素化，提示C2結構域在功能上屬于自我抑制基序。隨后，我們利用Ub及其K63、K48、K29、K11位賴氨酸殘基突變的質(zhì)粒與TRAF3、NEDD4L共轉染，以明確NEDD4L對TRAF3的泛素

15、化方式，發(fā)現(xiàn)K29賴氨酸殘基突變體(Ub-K29R)顯著抑制了NEDD4L對TARF3的泛素化，說明NEDD4L對TRAF3的修飾為K29泛素化修飾。
　　第二部分結果說明，NEDD4L通過其WW結構域與TRAF3相互結合，通過HECT結構域?qū)RAF3進行K29泛素化修飾，增強了下游信號分子IRF3的活化，促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，并且，C2結構域在功能上屬于自我抑制基序。
　　三、NEDD4L在體內(nèi)通過促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抵

16、御病毒感染
　　我們進一步探討了NEDD4L在病毒感染性疾病中的作用，我們通過腹腔注射VSV建立VSV感染的動物模型。發(fā)現(xiàn)NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠血清中的IFN-β的水平顯著低于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。
　　然后，我們檢測了VSV感染小鼠肝臟、脾臟中VSV的復制水平。數(shù)據(jù)顯示NEDD4 Lfl/flLyz2cre+小鼠脾臟和肝臟中VSV RNA擴增水平以及組織研磨液中VSVTCID50顯

17、著高于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。提示NEDD4L在體內(nèi)能夠抑制病毒在組織中的復制。
　　結果說明，VSV感染小鼠時，NEDD4L在體內(nèi)通過促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生抑制了VSV在組織細胞中的增殖，提高了小鼠的抗病毒能力。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中，NEDD4L能夠促進VSV誘導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生;明確了NEDD4L依賴其WW結構域直接與TRAF3相互結合，通過其HECT結構域?qū)RAF3進行K29泛素化