E3連接酶Smurf2在肝病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、泛素蛋白水解酶途徑通過(guò)特異性的泛素化修飾與靶蛋白的精細(xì)結(jié)合,對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾和降解起了關(guān)鍵作用,參與了各種生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞周期調(diào)控,信號(hào)傳導(dǎo),翻譯后修飾,細(xì)胞代謝、分化、增殖和腫瘤發(fā)生等。泛素蛋白水解酶途徑由泛素、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素蛋白連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶等組成。E3連接酶是其中最為關(guān)鍵的因子,它可以對(duì)不同的底物進(jìn)行特異性的識(shí)別,呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性,最終使泛素化的蛋白質(zhì)被26

2、S蛋白酶體所降解。Smurf2隸屬于C2-WW-HECT亞類的E3連接酶,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與細(xì)胞衰老,從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。本論文研究了Smurf2及其下游底物分子在肝癌、肝硬化和正常肝組織中的表達(dá)情況和分子間相互作用,分析了Smurt2對(duì)人類肝星狀細(xì)胞功能的影響,初步揭示了Smurf2在肝病中的作用機(jī)制。同時(shí)我們進(jìn)一步使用免疫共沉淀聯(lián)合LC-MS/MS方法,初步篩選和鑒定了Smurf2通路中的底物分子,并

3、對(duì)Smurf2泛素蛋白水解酶途徑相關(guān)的肝癌關(guān)鍵因子進(jìn)行探索,為肝病發(fā)生機(jī)制和治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分Smurf2及其底物的表達(dá)、相互作用和泛素化分析
　　 我們收集了肝癌、癌旁和肝臟良性病灶組織,按病理,分為肝癌、肝硬化和正常肝組織三組。分別采用Real-timePCR和WesternBlot方法,檢測(cè)Smurf2及其已知底物(Smad7、TβRI、SnoN)mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),和正常肝組織相

4、比,Smurf2在肝癌和肝硬化組織中表達(dá)下調(diào),該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Smad7和TβRI表達(dá)上調(diào),其差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SnoN在三組中的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。Smurf2和Smad7、TβRI在肝癌和肝硬化組織中的表達(dá)存在相反的關(guān)系,為此,我們使用免疫共沉淀分別進(jìn)行三個(gè)分子的相互作用研究和分析。以抗Smurf2抗體為一抗,在肝組織裂解液中行免疫共沉淀,其產(chǎn)物用抗Smad7和抗TβRI的抗體作WB檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smurf2

5、和Smad7和TβRI具有兩兩相互作用,形成異質(zhì)復(fù)合物。用抗泛素抗體為一抗,在肝組織裂解液中行免疫沉淀后,其產(chǎn)物分別用抗Smad7和TβRI抗體作WB檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)和泛素結(jié)合的分子包含Smad7和TβRI。為了證實(shí)何種底物被泛素化,我們使用抗Smurf2抗體為一抗,行免疫沉淀,再用抗Smad7或TβRI抗體行二次免疫沉淀,其產(chǎn)物用抗泛素抗體行WB檢測(cè),結(jié)果顯示Smad7和TβRI均被泛素化。
　　 第二部分TGFβ誘導(dǎo)Smurf

6、2表達(dá)與肝纖維化的關(guān)系研究
　　 我們檢測(cè)到Smurf2在肝硬化組織中的低表達(dá),為了闡明Smurf2在肝纖維化中的作用,我們通過(guò)培養(yǎng)活化的人肝星狀細(xì)胞LX-2,加用TGFβ1刺激后,檢測(cè)Smurf2、Smad7、TβRI蛋白表達(dá)水平的變化,用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中膠原含量情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過(guò)上調(diào)Smad7和Smurf2的表達(dá),減少膠原的分泌;過(guò)表達(dá)Smad7和Smurf2明顯抑制膠原分泌。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Smu

7、rf2的抑制膠原作用是通過(guò)泛素依賴的蛋白水解酶途徑,降解TβRI,減少TβRI表達(dá),抑制TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)而完成的;蛋白酶抑制劑MG132可以阻止該作用。因此,我們認(rèn)為,在肝硬化組織中Smurf2的低表達(dá),可能是TGFβ誘導(dǎo)Smurf2負(fù)反饋表達(dá)機(jī)制受損所致;Smurf2低表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)TβRI降解減少,對(duì)TGFβ信號(hào)通路失去抑制作用,導(dǎo)致了肝纖維化的進(jìn)展。
　　 第三部分Smurf2底物分子的初步篩選以及與泛素化途徑相關(guān)的肝癌關(guān)鍵

8、因子的探索
　　 上述結(jié)果顯示了Smurf2在肝臟中的重要作用,但是Smurf2通路的信號(hào)分子未被人們?nèi)堪l(fā)現(xiàn)和深入研究。我們利用Smurf2和其信號(hào)分子特異性結(jié)合的特性,在人類肝組織裂解液中,用Smurf2抗體進(jìn)行免疫共沉淀,行SDS-PAGE電泳后,聯(lián)合LC-MS/MS鑒定,初步發(fā)現(xiàn)了十余個(gè)Smurt2相關(guān)底物分子;其中8個(gè)在肝癌中存在,在正常肝組織中未被檢出;另有7個(gè)分子在正常肝組織存在,肝癌中未檢出。同時(shí),抗Smurf2

9、抗體免疫沉淀后產(chǎn)物直接行LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn),在正常肝組織中存在24個(gè)與Smurf2相聯(lián)系蛋白分子,肝癌組織中存在42個(gè)與Smurf2相關(guān)蛋白分子。其中包含文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的和肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白分子,如HSPβ1,也包含未知功能蛋白或者未被發(fā)現(xiàn)和肝癌相關(guān)的蛋白分子。由此可見(jiàn),用免疫沉淀聯(lián)合LC-MS/MS方法,更易于發(fā)現(xiàn)有意義的肝癌相關(guān)因子,縮小篩檢范圍。
　　 綜上所述,我們檢測(cè)了Smurf2和其底物分子Smad7和TβR

10、I在肝癌、肝硬化組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Smurf2和其底物分子的表達(dá)存在相反關(guān)系;Smurf2和Smad7、TβRI作用,形成異質(zhì)復(fù)合物;Smurf2以Smad7為調(diào)節(jié)子,通過(guò)泛素依賴的蛋白水解酶途徑降解TβRI,從而抑制TGFβ信號(hào)傳導(dǎo);在肝硬化中,TGFβ誘導(dǎo)Smurf2產(chǎn)生的負(fù)反饋機(jī)制受損,Smurf2低表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)TβRI降解減少,失去了對(duì)TGFβ信號(hào)通路的抑制作用,導(dǎo)致了肝纖維化的進(jìn)展;通過(guò)免疫沉淀聯(lián)合高敏感度的LC-MS/MS分