肺炎鏈球菌DnaJ對細菌毒力的影響及其在誘導宿主天然免疫反應中的作用.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，其引起的肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病在全球有很高的發(fā)病率和死亡率。近20年研究發(fā)現S.pn的許多蛋白，可作為炎癥介質或直接損傷宿主組織，且編碼這些蛋白的基因突變后，細菌的毒力顯著下降，因此S.pn的毒力蛋白在肺炎鏈球菌感染的發(fā)病機制中起重要作用。
　　細菌由外界環(huán)境進入宿主后必然面臨生存條件的改變，它們會應激性地調整基因表達以適應

2、環(huán)境的選擇壓力，細菌的熱休克蛋白(HeatShock Protein，HSP)正是應激誘導產生的一組對細菌本身具有保護作用的相關蛋白。從理論上講，這些應激表達的HSP往往是細菌潛在的毒力因子。因此全面理解肺炎鏈球菌HSP對自身毒力的影響及其與宿主免疫細胞間的相互作用將有助于抗肺炎球菌感染的新型治療試劑的開發(fā)。
　　DnaJ/Hsp40蛋白就是一種高度保守并廣泛存在的熱休克蛋白，作為DnaK的共分子伴侶，激活DnaK的ATPase活

3、性。S.pn的DnaJ蛋白是一種表面蛋白，已有研究顯示該蛋白具有疫苗的潛力，腹腔或粘膜接種使宿主產生抵抗多種血清型S.pn感染的獲得性免疫反應。但是，DnaJ蛋白是否參與細菌致病以及DnaJ蛋白與宿主天然免疫細胞的相互作用尚不清楚。
　　本研究分別從體內、體外兩方面觀察肺炎鏈球菌dnaJ缺陷對自身毒力的影響及DnaJ在誘導宿主天然免疫反應中的作用--促炎因子的分泌，模式識別受體(PRR)對DnaJ蛋白的識別，信號通路的激活。研究內

4、容包括以下三個部分：
　　1、構建.S.pn的dnaJ基因缺失的突變體，觀察溫度應激時其體外生長情況，為后續(xù)研究DnaJ在細菌和與宿主相互作用中所扮演的角色提供實驗菌株和技術平臺。
　　采用長臂同源多聚酶鏈式反應(LFH-PCR)方法，制備中間為紅霉素耐藥基因(erm)，兩側為dnaJ基因上、下游同源序列的連接片段，轉化肺炎鏈球菌D39或R6菌，在含紅霉素的血平板上篩選并采用PCR及測序鑒定缺陷菌株。結果顯示缺陷菌株的dna

5、J基因完全被erm基因替代；革蘭染色后形態(tài)無變化，但其菌落明顯變??；30℃和37℃時體外生長曲線與野生菌大體一致，但20℃和40℃時生長明顯受抑制，幾乎不能生長。
　　2、分別從體內、體外兩方面觀察肺炎鏈球菌dnaJ缺陷對自身毒力的影響。
　　腹腔攻毒后直接觀察感染野生菌或缺陷菌小鼠的生存情況；滴鼻感染S.pn建立小鼠肺炎模型，計數易感組織的細菌載量，明確dnaJ缺陷對細菌自身定植能力的影響；將S.pn感染小鼠肺上皮細胞ML

6、E12，比較野生和缺陷菌株黏附及侵襲能力的差異。毒力實驗顯示dnaJ缺陷菌組的小鼠可耐受致死劑量的S.pn并長期存活；定植實驗發(fā)現缺陷菌組小鼠鼻咽部和肺部的細菌載量均顯著低于野生菌組，并迅速清除入血的缺陷菌；dnaJ缺陷使S.pn對MLE12細胞的黏附侵襲能力顯著減弱，而且用抗DnaJ抗血清預處理MLE12后野生菌對該細胞的黏附能力明顯下降。
　　3、明確S.pn dnaJ基因缺陷后宿主或免疫細胞對該菌天然免疫反應的變化，再從分子

7、水平篩選宿主識別DnaJ誘導先天性免疫的模式識別受體和下游信號通路。
　　建立小鼠S.pn的肺炎模型，取感染肺組織切片染色觀察炎癥反應，定量PCR和ELISA檢測促炎因子的表達；小鼠巨噬細胞RAW264.7感染S.pn，比較該細胞對野生菌和缺陷菌的吞噬能力及炎癥因子分泌水平；原核表達并純化DnaJ全長蛋白刺激RAW264.7，檢測促炎因子的水平，定量PCR篩選識別DnaJ蛋白的TLRs，并用抗TLRs單抗驗證，蛋白激酶抑制劑篩選D