肺炎鏈球菌LicC蛋白在致病過程中作用的研究.pdf

1、肺炎鏈球菌普遍定植于呼吸道，是人類重要的侵襲性病原菌之一，是社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、菌血癥、鼻竇炎的主要病原菌，其引起的腦膜炎和菌血癥死亡率高。肺炎鏈球菌主要感染2歲以下幼兒及65歲以上老年人，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致兒童死亡的最重要原因之一。另一方面，自上世紀(jì)60年代中期發(fā)現(xiàn)第一株對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌(PRSP)以來，耐藥狀況發(fā)展迅速，分離率明顯上升，在一些國家和地區(qū)，PRSP已高達40％～50％。并且，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，PRSP

2、菌株中，有60％～90％同時對氯霉素、克林霉素、磺胺甲基異惡唑、紅霉素、四環(huán)素耐藥。隨著近年來肺炎鏈球菌耐藥性的不斷增強和有效疫苗的缺乏，新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)變得越來越重要，肺炎鏈球菌致病相關(guān)基因愈來愈受到關(guān)注和重視。
　　我們在前期研究中采用信號標(biāo)簽突變技術(shù)(Signaturetaggedmutagenesis,STM)構(gòu)建了肺炎鏈球菌突變體文庫，篩選到了一個新的肺炎鏈球菌致病相關(guān)基因licC(CTP:Phosphocholine

3、Cytidylyltransferase)。它是核苷轉(zhuǎn)移酶家族的獨特成員，編碼磷酸化膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(CTP:phosphocholinecytidylyltransferase,CCT)，負責(zé)生成二磷酸胞嘧啶膽堿（CDP-Cho），是合成磷酸化膽堿(phosphocholine,PCho)的關(guān)鍵酶之一。研究表明，膽堿代謝在肺炎鏈球菌的細胞分裂、轉(zhuǎn)化、自溶和致病過程中具有重要作用，PCho不僅本身就是一個毒力因子，與其結(jié)合在一起的膽堿結(jié)

4、合蛋白更是肺炎鏈球菌黏附和侵襲必不可少的因素。前期實驗中，我們建立了STM插入突變株，插入點位于licC3’端78bp處，實驗表明，licC基因的突變可使細菌毒力顯著減弱、生長嚴(yán)重受抑，并且與多種毒力因子相關(guān)聯(lián)。同時，licC在肺炎鏈球菌中極為保守，與其他真核和原核細胞相應(yīng)基因缺乏同源性，是一個理想的藥物靶點，在研究新型抗肺炎鏈球菌藥物方面具有良好前景。
　　在此基礎(chǔ)上，本研究將進一步探討STM插入突變株在生物學(xué)特性和毒力方面發(fā)生

5、變化的原因，尋找LicC的重要功能位點，研究該基因在肺炎鏈球菌生長和致病過程中的作用，并構(gòu)建licC低表達菌株，為針對licC的藥物篩選打下基礎(chǔ)。
　　本實驗構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE80-licC、pQE80-?licC，包含了licC的全序列和licC截短體(?licC)。其中?licC為3’端78bp缺失的licC序列，與STM插入突變株中l(wèi)icC的缺失部分一致?？扇苄苑治霰砻?，E.coliBL21成功表達目的蛋白，LicC及?L

6、icC均在上清中有表達，并通過親和層析獲得純化蛋白。實驗中，自行建立了生物發(fā)光技術(shù)，用以測定表達蛋白的酶活性，結(jié)果顯示?licC的活性僅相當(dāng)于全序列蛋白的6％，證實缺失區(qū)域與酶活性密切相關(guān)。由于缺失部分包含了與Mg2+結(jié)合的Glu216，我們推測活性減低與缺失了該谷氨酸關(guān)系密切；從而解釋了STM突變株生長減慢、毒性減低的原因，證實缺失區(qū)域是LicC重要的功能位點之一。
　　構(gòu)建licC缺失突變株并進行一系列相關(guān)功能試驗是研究Lic

7、C在肺炎鏈球菌致病過程中作用的重要方法。我們擬采用構(gòu)建多個突變子（上游同源臂+篩選標(biāo)記序列+下游同源臂）轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌、通過同源重組的方法獲得licC缺失突變株。但是，即使構(gòu)建的6個突變子覆蓋了licC不同長度的缺失基因，不同長度的上、下游同源臂及不同的抗生素篩選標(biāo)記基因；同時，設(shè)置肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化陽性對照對轉(zhuǎn)化過程進行質(zhì)量控制的情況下，仍然未能獲得licC缺失突變株。即使得到了一株下游同源臂發(fā)生同源重組的突變株，但該突變株中，licC仍

8、是完整基因（licC的缺失突變由上游同源臂引發(fā)）；而同源重組構(gòu)建策略已證明是構(gòu)建肺炎鏈球菌突變株簡便、高效、成熟的方案，在大量研究中均得到運用；于是，結(jié)合文獻，我們認(rèn)為licC是肺炎鏈球菌的必需基因，同樣證實了將licC作為藥物靶點的可行性。
　　在構(gòu)建licC缺失突變株過程中，仍然獲得了一株下游同源臂發(fā)生同源重組而將抗生素篩選標(biāo)記序列整合入基因組的突變株。我們推測，出現(xiàn)該突變株的原因可能有：①下游同源臂發(fā)生預(yù)期的同源重組，導(dǎo)致突

9、變子的一端嵌入基因組。licC②是必需基因，難以由缺失的licC序列的上游同源臂替換licC全序列而發(fā)生預(yù)期的同源重組。③抗生素壓力下，將抗生素篩選標(biāo)記序列整合入基因組。經(jīng)測序證實，雖然licC未發(fā)生缺失突變，但licC的下游基因dprA發(fā)生了插入突變。相關(guān)實驗證實該突變株黏附能力下降（僅相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)株的約30％）、疏水性發(fā)生改變、約100KD的膽堿結(jié)合蛋白缺失，從而首次證實dprA與肺炎鏈球菌毒力相關(guān)，具體機制仍有待研究。由于dprA是

10、肺炎鏈球菌自然轉(zhuǎn)化的必需基因，本實驗結(jié)果為將肺炎鏈球菌的自然轉(zhuǎn)化和毒力進行聯(lián)合研究打開了思路。
　　反義RNA(AntisenseRNA,ASRNA)作為有效抑制目的基因表達的手段已為大家所公認(rèn)。本實驗通過該方法構(gòu)建了LicC低表達株。實驗中設(shè)計了3條反義RNA，分別代表了不同的長度，即licC基因5’端321bp、506bp、708bp片段，利于從中挑選出抑制效果較好的ASRNA。以抗LicC抗體為一抗的westernblot表

11、明，3條ASRNA均有一定程度的抑制作用，成功構(gòu)建了licC低表達株。該低表達菌株的獲得彌補了未能建立licC缺失突變株的缺憾，對licC在生物學(xué)特性、致病力等方面的研究具有重要意義，并且為針對LicC的全細胞藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究成功闡釋了STM插入突變株在生長和毒力方面發(fā)生變化的原因，證實了3’端78bp是licC的重要功能位點；針對licC進行同源重組構(gòu)建突變株的失敗反向證實了licC是肺炎鏈球菌的必需基