肺炎鏈球菌肽鏈內(nèi)切酶O(PepO)在宿主固有免疫激活中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌肽鏈內(nèi)切酶 O(PepO)是一種新近發(fā)現(xiàn)的且保守表達(dá)的肺炎鏈球菌毒力蛋白，可幫助細(xì)菌黏附侵襲入宿主細(xì)胞。有研究顯示一些毒力因子可與宿主固有免疫受體相互作用，激活特異的信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)宿主的免疫防御反應(yīng)。那么PepO作為一種毒力因子是否參與了宿主固有免疫反應(yīng)的激活？其作用機(jī)制又是怎樣的呢？探索毒力因子與宿主的相互作用機(jī)制可能推動(dòng)抗菌藥物以及蛋白疫苗的研發(fā)，因此本研究旨在探索PepO在宿主固有免疫激活中的作用及機(jī)制。

2、>　　方法：利用原核表達(dá)重組蛋白技術(shù)制備重組 PepO（rPepO）蛋白溶液。構(gòu)建氣管內(nèi)滴注rPepO的小鼠模型，在體內(nèi)評(píng)價(jià)rPepO的固有免疫激活效應(yīng)。采用小鼠腹腔分離的巨噬細(xì)胞（PEMs）、小鼠肺上皮細(xì)胞株（MLE-12）、人支氣管上皮細(xì)胞株（Beas-2B）在體外明確rPepO發(fā)揮免疫激活作用的效應(yīng)細(xì)胞并進(jìn)一步研究相關(guān)的信號(hào)通路。利用定量PCR（Q-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析rPepO誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)。通過(guò)組織

3、切片及蘇木精-伊紅（HE）染色分析肺組織內(nèi)的炎性改變。利用流式細(xì)胞術(shù)及瑞士-吉姆薩染色分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中有核細(xì)胞的種類(lèi)。利用小分子抑制劑、蛋白印跡、免疫熒光試驗(yàn)分析rPepO激活的相關(guān)信號(hào)通路。
　　結(jié)果：證實(shí)了PepO在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)小鼠較強(qiáng)的固有免疫反應(yīng)。氣管內(nèi)滴注 rPepO后，小鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子分泌顯著增加且肺內(nèi)出現(xiàn)廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與野生小鼠相比， Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣

4、受體4（TLR4）缺陷小鼠分泌的細(xì)胞因子、趨化因子顯著減少（p﹤0.001），中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)也顯著減少，但組織損傷更為嚴(yán)重。在體外實(shí)驗(yàn)中，rPepO可刺激PEMs分泌白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、CXCL1和CXCL10，該效應(yīng)依賴(lài)于 TLR2、TLR4以及 p38、Akt和 p65的激活。而 rPepO通過(guò)MAPKs-NF-κB-PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn) MLE-12細(xì)胞分泌 IL-6和CXCL1，通過(guò)PI3