肺炎鏈球菌假想蛋白SPD0873功能分析及對細(xì)菌毒力影響的機制研究.pdf

1、由于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)抗生素耐藥率的增加和目前疫苗本身的缺陷,使得其防治成為了一個很棘手的問題。要想徹底解決這個問題,就要深入其致病機制,為新藥物和疫苗的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 在前期研究中,我們通過體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IVET),篩選出了與肺炎鏈球菌毒力相關(guān)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因(in vivo-induced gene,ivi gene)。經(jīng)過對這些基因的生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)sp

2、d-0873基因所編碼的產(chǎn)物,假想蛋白SPD-0873與肺炎鏈球菌中的LytC有相似的功能結(jié)構(gòu)域,LytC的陰性突變菌株生物被膜形成能力下降。所以我們推測它是一個功能類似于LytC的新的毒力因子。
　　 目的：本研究將對假想蛋白SPD-0873的生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定,并探索spd-0873基因影響細(xì)菌毒力的機制。
　　 方法：通過水解底物PNP-(GlcNAc)5實驗來確定蛋白SPD-0873是否具有溶菌酶的功能；采用長臂

3、同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Long flankinghomology polymerase chain reaction,LFH-PCR)方法制備spd-0873缺陷菌,利用小鼠體內(nèi)實驗比較缺陷菌和野生菌的毒力是否存在差異；通過描繪細(xì)菌生長曲線、透射電鏡、莢膜染色來觀察體內(nèi)、外莢膜合成能力、體外粘附宿主細(xì)胞實驗等方法,進(jìn)一步了解假想蛋白SPD-0873的功能,通過熒光定量PCR比較缺陷菌和野生菌中幾種主要的毒力因子的表達(dá)差異,探索spd-08

4、73基因影響細(xì)菌毒力的機制。
　　 結(jié)果：通過生物信息學(xué)分析可知,spd-0873的編碼產(chǎn)物含有β-1-4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶結(jié)構(gòu)域,該酶屬于糖基水解酶25家族,可以水解細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡糖按(NAG)之間的β-1,4糖苷鍵。溶菌酶實驗結(jié)果顯示,卵清溶菌酶和SPD-0873重組蛋白均可使底物PNP-(GlcNAc)5釋放出游離的對硝基苯酚,OD405nm吸光度值分別為1.166和0.792；小鼠體內(nèi)毒

5、力實驗顯示,野生菌和缺陷菌的死亡時間分別是感染后11h和36h,缺陷菌毒力較野生菌顯著降低(P<0.001)；體外生長曲線顯示,缺陷菌的增殖能力較之野生菌顯著降低；透射電鏡顯示:體外培養(yǎng)缺陷菌莢膜丟失,感染小鼠后莢膜可恢復(fù),而野生菌體外、體內(nèi)均有莢膜；缺陷菌體外粘附能力較之野生菌顯著增強(P<0.01)；同野生菌比較,溶血素(pneumolysin,ply)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,nanA)在缺陷菌中表達(dá)量分別降低了1