人工培育小鼠MII卵制備胚胎干細(xì)胞研究.pdf

1、目的：探討人工培育小鼠MII卵制備胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)的可行性。期望建立適宜的技術(shù)模型，用以解決醫(yī)療性克隆中人次級(jí)卵母細(xì)胞(MII卵)來源匱乏的問題。 方法：將新生0.5d的B6D2F1小鼠卵巢同種異體移植至卵巢切除的B6D2F1受體鼠腎被膜下；14d后取出卵巢移植物，分別采用機(jī)械法、長(zhǎng)時(shí)酶解法、短時(shí)酶解法、酶解—機(jī)械相結(jié)合的分離方法分離出竇前卵泡。分離得到的竇前卵泡在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1

2、2d，觀察各組卵泡的存活率、排卵率以及各組卵母細(xì)胞的成熟率、受精率：在實(shí)驗(yàn)一中，卵丘復(fù)合體(cumulus-oocytecomplexes COCs)在人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)培養(yǎng)體系中的不同時(shí)間收獲，所得COCs行體外受精(IVF)后觀察各組COCs的卵母細(xì)胞成熟率、受精率和早期胚發(fā)育能力。在實(shí)驗(yàn)二中，根據(jù)培養(yǎng)體系中胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)濃度分

3、為5％FCS組和1％FCS組，12天后，評(píng)價(jià)各組卵母細(xì)胞的成熟率、受精率和早期胚發(fā)育能力。人工培育MII卵所得囊胚轉(zhuǎn)移至成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)，用常規(guī)技術(shù)制備胚胎干細(xì)胞。 結(jié)果：共移植了200枚卵巢至8-10周齡去除卵巢的B6D2F1雌鼠的腎被膜下，移植2周后取到了197個(gè)移植卵巢，收獲率為98.5％。采用酶解—機(jī)械結(jié)合法從每個(gè)卵巢移植塊獲得97.13+5.30個(gè)卵泡(相當(dāng)于194卵泡/卵巢)，結(jié)合法分離卵泡的存活率與單純酶

4、解法無差別但高于單純機(jī)械法，而該法每塊卵巢的卵泡回收量、平均排卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率多項(xiàng)指標(biāo)均高于其它方法，各種分離方法所培育的卵母細(xì)胞受精率在各組間并無顯著差異。在實(shí)驗(yàn)一中，hCG作用26h得到的卵丘復(fù)合體比其它組有更高的卵母細(xì)胞成熟率；在實(shí)驗(yàn)二中，5％ FCS組誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞具有高受精率的趨勢(shì)。從人工培育MII卵受精得到的囊胚在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)良好，可見呈柱狀生長(zhǎng)的內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass，ICM)，將其消化所得細(xì)胞在