MicroRNA-199a在小鼠肥胖發(fā)生中的作用研究.pdf

1、目的：
　　研究miR-199a對肥胖小鼠整體糖脂代謝狀況的影響;探討miR-199a與脂肪分化、脂肪生成相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶增殖物激活受體(PeroxisomeProliferator Activated Receptor gamma，PPARγ)、CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer binding proteins alpha, C/EBPα）、脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白（adipocyte fatty

2、 acid-binding protein，aP2）以及固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1(sterolregulatory element binding protein-1，SREBP1)等基因的關(guān)系，進(jìn)一步明確miR-199a基因與肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，為深入理解脂肪分化障礙相關(guān)的肥胖機(jī)制及治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取40只雄性C57/BL6J小鼠(18～22g):20只普通C57/BL6J小鼠，20只敲除瘦素小鼠（ob

3、/ob小鼠），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按照2*2析因分析設(shè)計(jì)分成4組:對照組(C1)、高脂組(C2)、敲瘦素組(O1)、敲瘦素高脂組(O2)。其中，高脂組和敲瘦素高脂組飼喂高脂飼料，其余兩組飼喂正常飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周。每周稱量體重，測量體長，記錄飲水量、攝食量等一般情況。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，利用雙能X射線掃描儀進(jìn)行活體全身體脂肪（不包括頭部）的測定;使用安穩(wěn)血糖儀進(jìn)行血糖水平的測量;采用多功能酶標(biāo)儀測量甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽

4、固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol，HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的吸光度OD值;采用Folch法從白色脂肪組織中提取脂質(zhì)，采用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)和TG的測定;采用蘇木精-伊紅(H&E)染色

5、方法對白色脂肪組織進(jìn)行石蠟切片染色，采用油紅O染色方法對白色脂肪組織進(jìn)行冰凍切片染色;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法中的SYBR Green法檢測miR-199a、PPARγ2、C/EBPα、aP2、SREBP-1c在各組小鼠脂肪組織中的的表達(dá)水平，同時(shí)采用Taqman探針法復(fù)檢測miR-199a在各組小鼠脂肪組織中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠進(jìn)食量、周體重、Lee's指數(shù)、全身脂肪含量
　　各組小鼠在喂養(yǎng)期

6、間進(jìn)食量、體重穩(wěn)定增加。敲瘦素高脂組(O2)體重、Lee's指數(shù)、全身脂肪含量最高，對照組(C1)相應(yīng)檢測指標(biāo)最低。進(jìn)行析因分析后，其中兩處理因素（瘦素基因與高脂喂養(yǎng)）在體重、全身脂肪含量指標(biāo)中存在交互作用(P＜0.05);
　　2.各組小鼠相關(guān)糖脂代謝指標(biāo)水平
　　各組小鼠血糖水平雖有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C水平及脂質(zhì)中FFA、 TG含量在瘦素基因

7、水平（有或無）上均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，敲瘦素基因的小鼠(O1組、O2組)各糖脂代謝指標(biāo)水平均高于非敲除組（C1組、C2組）;在飲食水平上，血清中TG、TC，脂質(zhì)中FFA、TG水平出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，水平均高于正常飼料組小鼠;
　　3.各組小鼠脂肪細(xì)胞體積及脂滴大小
　　H&E染色結(jié)果顯示，肥胖組小鼠（O1組、O2組）單位面積內(nèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)較非肥胖組小鼠（C1組、C2組）數(shù)目減少，兩處理因素（瘦素基因和飲食水平）都出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)差異(P＜0.05);油紅O染色可見，肥胖組脂滴較非肥胖組大;
　　4.miR-199a、PPARγ2、C/EBPα、aP2、SREBP-1c的相對表達(dá)水平
　　SYBR Green法檢測肥胖組小鼠miR-199a、PPARγ2、C/EBPα、aP2、SREBP-1c的相對表達(dá)量較非肥胖組高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;Taqman探針法檢測miR-199a肥胖組表達(dá)水平較高，與SYBR Green法檢測具有一致性，相

9、關(guān)系數(shù)r為0.72，為正相關(guān)關(guān)系，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　5.miR-199a表達(dá)水平與Lee's指數(shù)、全身脂肪含量及脂質(zhì)中FFA、TG的相關(guān)性
　　miR-199a表達(dá)水平與上述指標(biāo)存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.60、0.64、0.53、0.85，都具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.高能量飼喂和敲瘦素基因都可促進(jìn)肥胖的發(fā)生，具體表現(xiàn)為體重增加、Lee'

10、s指數(shù)變大、體脂肪含量積聚、糖脂代謝紊亂、游離脂肪酸和甘油三酯增加、脂肪細(xì)胞體積和脂滴變大;
　　2.高能量飼喂和敲瘦素基因可同時(shí)促進(jìn)肥胖的發(fā)生，二者具有相關(guān)性，或存在交互作用（表現(xiàn)為協(xié)同作用）;
　　3.肥胖小鼠miR-199a、PPARγ2、C/EBPα、aP2、SREBP-1c基因在脂肪組織中的表達(dá)上調(diào)，miR-199a與PPARγ2、C/EBPα等脂肪分化因子在脂肪組織中表達(dá)一致，提示miR-199a基因可能通過參與