SIRTl在宮頸癌發(fā)生中作用的初步研究.pdf

1、目的:第Ⅲ類組蛋白去乙?；敢喾Q為Sirtuins，即沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator2，Sir2）的同源蛋白，研究表明SIRT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新靶點。本研究擬通過在組織水平檢測宮頸癌SIRT1的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系；在細胞水平研究SIRT1對宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及其Notch信號通路相關(guān)蛋白的影響，探討SIRTl在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展

2、中的作用機制及其與Notch-Hes信號通路的關(guān)系。
　　方法:收集2012年9月-2014年3月青島大學附屬醫(yī)院病理科宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織石蠟標本，選取臨床病理資料完整者221例（包括CIN I級，CIN II-CIN III級，宮頸鱗癌及正常宮頸組織）。免疫組織化學方法檢測SIRT1蛋白的表達，分析其表達與臨床指標的相關(guān)性；化學合成靶向SIRT1基因的小干擾RNA（siRNA），以Lipofectamine RNAiMA

3、X脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染SiHa細胞，轉(zhuǎn)染72h后，提取各組總RNA及總蛋白。RT-PCR檢測SiHa細胞SIRT1 mRNA的表達，免疫印跡法檢測SiHa細胞中SIRT1、Notch1、Hes1及cyclinD1蛋白的表達，細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8)檢測細胞增殖抑制率，遷移侵襲實驗檢測SiHa細胞的遷移侵襲能力，分別應用AnnexinV-PE雙染法及Hoechst33258染色法檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示：SIR

4、T1在正常宮頸組織及程度較輕的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINI級）中未見陽性表達；67例CINII-III組織中有16例SIRT1陽性（23.9％）；而54例宮頸癌組織中29例SIRT1表達陽性（53.7％）。RT-PCR結(jié)果表明：與空白細胞對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組、SIRT1陰性對照組相比，siRNA-SIRT1干擾組細胞SIRT1 mRNA表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。Western blot顯示：與對照組相比，siRNA-SIRT1干擾組細

5、胞SIRT1蛋白表達量明顯下調(diào)(P＜0.05)，cyclinD1、Notch1和Hes1蛋白的表達明顯上調(diào)(P＜0.05)。CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果表明：siRNA-SIRTl轉(zhuǎn)染組抑制率為37％，SIRT1陰性對照組抑制率為8.7％，轉(zhuǎn)染試劑對照組抑制率7.3％，轉(zhuǎn)染組抑制率明顯高于其他組。Transwell遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，siRNA-SIRT1干擾組穿過人工基底膜細胞數(shù)明顯減少。流式細胞術(shù)結(jié)果表明：siRNA

6、-SIRT1干擾組凋亡率為16％而SIRT1陰性對照組凋亡率僅為2.6％。Hoechst33258染色顯示：siRNA-SIRT1干擾組SiHa細胞核明顯變小，其染色質(zhì)濃縮，并可見凋亡小體，而SIRT1陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組和空白細胞對照組細胞核呈均勻淡藍色。
　　結(jié)論:靶向SIRT1基因的siRNA能有效抑制SiHa細胞的增殖、遷移及侵襲并誘導細胞凋亡，siRNA-SIRT1誘導的細胞凋亡與Notch-Hes信號通路密切相關(guān)