水稻端粒酶RNA候選序列的克隆及特征研究.pdf

1、端粒酶是一種由端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒酶RNA(TER)構成的核糖核蛋白復合體，端粒酶RNA中有一段端粒合成時所需要的模板區(qū)。傳統(tǒng)的DNA復制機制無法完成端粒序列的完整復制，隨著細胞的持續(xù)分裂，端粒長度會逐漸縮短。端粒酶則可以催化端粒序列的延伸，防止染色體末端降解或融合的發(fā)生。
　　 端粒酶主要分布于細胞分裂旺盛的組織中，并對細胞的分裂起著重要的調(diào)控作用。完全分化的動植物細胞均不具有端粒酶活力。人體中有些即將衰老的細胞在

2、一些特殊條件下發(fā)生逃逸，重新表達端粒酶而成為具有無限增值能力的癌細胞。成熟的植物細胞在誘導成為愈傷組織以及再分化為植株的過程中，也存在著端粒酶的重新表達;端粒酶將染色體末端的端粒序列延長，使得細胞又可以進行分裂增殖。人體中已經(jīng)實現(xiàn)了以端粒酶RNA為靶標的癌癥治療。然而植物端粒酶在有限組織中的低量表達以及端粒酶RNA復雜的二級結構，造成端粒酶RNA的克隆十分困難。目前，僅獲得了擬南芥端粒酶RNA的序列。
　　 本研究的目的是探究一

3、種快速有效的提取植物端粒酶的方法并克隆水稻端粒酶RNA，通過生物信息學技術預測分析水稻與擬南芥端粒酶RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，探究植物端粒酶RNA的結構及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。由于端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，長時間的操作容易導致端粒酶失活，而分離的蛋白在酶促反應時不存在端粒酶活力，就無法進行后續(xù)的端粒酶RNA序列克隆。核糖體是影響低表達量端粒酶富集及端粒酶RNA克隆的主要因素。我們在研究中利用核糖體大小亞基偶聯(lián)及解聚的動態(tài)平衡受鎂離子濃度調(diào)

4、控的機制，提高裂解液中鎂離子的濃度至15mM，使核糖體大小亞基最大程度的偶聯(lián)在一起。然后，利用不同濃度的PEG6000能夠選擇性的沉降不同分子量的生物大分子的性質(zhì)，設計了0％、2％、4％、6％、8％、10％共6組PEG6000工作濃度，并用PEG6000的這6組工作濃度對裂解液萃取的上清液中的蛋白進行選擇性的沉淀，離心后取上清液測定端粒酶活力。結果表明，PEG6000工作濃度為4％時，可以有效的沉淀雜蛋白并且提取液中端粒酶的活力最高。從

5、富集的端粒酶提取液中分離RNA，并用聚丙烯酰胺尿素變性電泳分離。電泳結果顯示有效的降低了核糖體18SrRNA和28SrRNA的干擾。
　　 然后，我們從PEG6000工作濃度為4％的條件下得到的端粒酶提取液中提取RNA，并用T4RNA連接酶在RNA的3'端連接單鏈接頭。由于端粒酶RNA的模板區(qū)序列可能有多種排列方式，我們在以前實驗數(shù)據(jù)的基礎上設計了5種上游引物。通過對PCR體系及程序的優(yōu)化，我們最終克隆到了大小分別為862bp、

6、292bp、459bp和1040bp的4條目的條帶;與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進行blast比對發(fā)現(xiàn)，292bp的未知序列中含有可以作為端粒序列模板的區(qū)域，模板區(qū)序列為5'-AAACCCTAA-3'。該模板區(qū)可以以AA為錨定位點，以AGGGTTT為復制單元合成端粒重復序列。此外，模板區(qū)3'端以AA結尾也與我們之前研究發(fā)現(xiàn)的端粒酶在體外延伸時優(yōu)先合成以TT結尾的引物序列相吻合。因此，我們認為292bp的目的片段很可能是水稻端粒酶RNA的下游序列。

7、
　　 我們通過NCBI中水稻和擬南芥的基因組數(shù)據(jù)庫獲取了端粒酶RNA模板區(qū)上游1000bp的核酸序列，然后分別使用PromPridect和PLACE數(shù)據(jù)庫對兩者的啟動子位點和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行了預測分析。結果顯示兩者具有類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，在-40～-50bp區(qū)均有TATABOX元件;在轉(zhuǎn)錄起始位點沒有起始密碼子ATG，這也與端粒酶RNA為非編碼RNA相符。此外兩者還都具有CAATBOX、CACT、EBOXNNAPA、GATAB