人端粒酶RNA(hTER)的純化與結(jié)構(gòu)解析.pdf

1、端粒酶是一類獨(dú)特的核糖核蛋白復(fù)合物，主要負(fù)責(zé)維護(hù)染色體末端端粒的完整性，以防止不完全DNA復(fù)制所造成的基因信息缺失，同時(shí)保護(hù)染色體的降解和重組。1985年，著名美國科學(xué)家、諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎獲得者Elizabeth H. Blackburn和Carol W. Greider首次在四膜蟲（Tetrahymena）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和鑒定出端粒酶。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶在大部分癌癥中扮演上調(diào)因子的角色，同時(shí)其結(jié)構(gòu)域的突變與多種早衰疾病相關(guān)，因此，在過去的二十

2、年里，端粒酶成為了生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)，尤其是人端粒酶。人端粒酶主要由一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）和一個(gè)提供逆轉(zhuǎn)錄模板的 RNA（hTER）以及一系列輔助蛋白組成。其中，人端粒酶RNA（hTER）的突變所導(dǎo)致的人端粒酶缺陷與幾種人類遺傳疾病相關(guān)，如先天性角化不良、再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良和先天性肺纖維化等，因此，作為人端粒酶全酶的重要組成部分，對hT ER的分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究可為相關(guān)疾病的治療和藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。然而，在研

3、究hT ER結(jié)構(gòu)這方面，目前不管是二級結(jié)構(gòu)還是通過結(jié)晶實(shí)驗(yàn)獲得三維結(jié)構(gòu)，都因其較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征而無法完成全長的三維結(jié)構(gòu)解析，僅停留在部分區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的研究。
　　人端粒酶RNA（hTER）是一條含有451個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，本文采用體外轉(zhuǎn)錄法獲得 hTER，并以 SHAPE化學(xué)法（Selective2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extens ion），即通過 NMIA

4、（ N-methylisato ic anhydride）或1M7（1-methyl-7-nitro isatoic anhydride）等小分子修飾hTER后，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄獲取對應(yīng)的cDNA片段，以此來分析RNA序列的單核苷酸自由度和動態(tài)結(jié)構(gòu)特性，為體外獲悉 hT ER全長的二級結(jié)構(gòu)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。S HAP E化學(xué)法是基于核糖2’-OH位置的親核性，因此比起受堿基對和其他作用力束縛的核苷酸，不受約束的核苷酸能形成更多可以提高2’-OH

5、親核力的構(gòu)象，從而與具有羥基選擇性的親電體，如NMIA和1M7形成穩(wěn)定的2’羥基加合物。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)易在加合物處停止，從而生成不同長度的cDNA，通過檢測不同長度cDNA的熒光值，可找到對應(yīng)核苷酸的位置和自由度大小，從而判斷該核苷酸在整個(gè)RNA結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)特征。
　　本課題獲得了以下成果：1）設(shè)計(jì)hT ER-S hap e基因和其對應(yīng)的引物，并優(yōu)化了PCR（polymerase chain reaction）反應(yīng)體系

6、，得到了高濃度、高純度的DNA作為體外轉(zhuǎn)錄的基因模板；2）通過體外轉(zhuǎn)錄獲得了hTER轉(zhuǎn)錄本，并對RNA進(jìn)行純化，得到了滿足SHAPE實(shí)驗(yàn)要求的hT ER全長；3）摸索單引物一步法延伸完成較長R NA（大于300 nt）的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件，相比運(yùn)用多個(gè)引物，提高了結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確度，其中對于hTER（451 nt），當(dāng)選用1μM/L hTER初始濃度和49℃延伸溫度時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效果最佳，為其他類似高GC含量、序列較長的R NA提供了實(shí)驗(yàn)

7、基礎(chǔ)；4）探索得到1μM/L hT ER經(jīng)3.9 mM/L NMIA或5 mM/L1M7修飾效果較好；5）采用ShapeFinder軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果，預(yù)測當(dāng)無 hT ERT蛋白時(shí)，hTER的模板區(qū)域一部分掩埋在三維結(jié)構(gòu)中，該區(qū)域核苷酸自由度較低，一部分暴露在外，該區(qū)域核苷酸自由度相對較高；CR4/CR5結(jié)構(gòu)域中P6.1具有相對較高的自由度，可能是hT ERT蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。同時(shí)，ScaRNA結(jié)構(gòu)域中的Box