質(zhì)粒介導(dǎo)RNA干擾靶向hTERT抑制K562細(xì)胞端粒酶活性的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以hTERT為作用靶點(diǎn)，運(yùn)用RNAi技術(shù)，將能表達(dá)hTERT-siRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，旨在探索有效降解hTERTmRNA、抑制端粒酶活性的siRNA序列，觀察質(zhì)粒載體誘導(dǎo)RNAi維持目的基因沉默的持續(xù)時(shí)間，為RNAi技術(shù)在端粒酶抑制劑和腫瘤治療方面的應(yīng)用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 研究方法： (1)根據(jù)端粒酶hTERT基因序列依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成三條21bp的siRNA鏈，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞觀察hTER

2、T抑制效應(yīng)，根據(jù)結(jié)果選取兩條能高效特異抑制目的基因hTERTmRNA表達(dá)的siRNA鏈，然后分別設(shè)計(jì)合成2對(duì)65nt的寡核苷酸(shDNA)用以構(gòu)建表達(dá)載體，shDNA基本結(jié)構(gòu)為：BamHISense+Loop+Antisense+終止信號(hào)(TTTTTT)+SalⅠ+HindⅡ，將互補(bǔ)的兩條單鏈寡核苷酸退火連接到質(zhì)粒載體中，經(jīng)酶切結(jié)果鑒定是否成功構(gòu)建。 (2)以人紅白血病細(xì)胞株k562為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分五組：空白對(duì)照組、pGC-

3、hTERT-1、pGC-hTERT-2、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(pGC-GAPDH)。 (3)選取生長(zhǎng)健康處于分裂增殖期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(0.5-1)×106/ml，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)各組質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，作用48h和72h后收集細(xì)胞，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察各作用組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，然后用含G418的培養(yǎng)液對(duì)各作用組的細(xì)胞進(jìn)行篩選，直至空白對(duì)照組的細(xì)胞全部殺死，收集其它作用組細(xì)胞進(jìn)行結(jié)果測(cè)定。 (4)分

4、別用RT-PCR檢測(cè)靶基因hTERTmRNA和GAPDH基因的表達(dá)情況、PCR-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞的端粒酶活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各作用組細(xì)胞凋亡率。 研究結(jié)果： (1)三條化學(xué)合成的siRNA鏈中，有兩條siRNA-1和siRNA-2在48h能明顯抑制hTERTmRNA的表達(dá)，抑制率分別為85﹪和45﹪，故選此二鏈構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。 (2)質(zhì)粒載體插入目的基因片段之后，PstⅠ酶切位點(diǎn)被取代，故不能被Pst

5、Ⅰ所酶切，插入的目的基因片段里設(shè)計(jì)了一個(gè)SalⅠ的酶切位點(diǎn)，故能被SalⅠ酶切出一條約400bp的DNA片斷，凝膠電泳圖譜均顯示有一條約400bp的DNA片斷，故質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。 (3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡顯示各作用組細(xì)胞中均有綠色熒光蛋白，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為pGC-hTERT-1組5.74﹪，pGC-hTERT-2組5.66﹪，陰性對(duì)照組7.5﹪，pGC-GAPDH組4.31﹪。

6、(4)細(xì)胞在G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天后，空白對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，收集篩選后的K562細(xì)胞進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。 (5)RT-PCR結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組(pGC-GAPDH)的GAPDHmRNA表達(dá)較1-4組明顯下調(diào)，與陰性對(duì)照組相比pGC-hTERT--1組pGC-hTERT-2組在48h和72hhTERTmRNA的表達(dá)都下調(diào)，且以pGC-hTERT-1組的作用更加明顯。 (6)端粒酶活性pGC-hTERT-1作用組48h(0

7、.552±0.031)72h(0.382±0.11)、pGC-hTERT-2作用組48h(0.61±0.042)72h(0.52±0.72)與陰性對(duì)照組(0.786±0.314)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 (7)細(xì)胞凋亡率pGC-hTERT-1組48h(14.33±1.16﹪)pGC-hTERT-2組48h(10.41±1.26﹪)與陰性對(duì)照組(7.64±0.484﹪)相比有顯著性差異(P＜0.05)，72h細(xì)胞凋亡率漸

8、下降pGC-hTERT-1組(10.02±0.85﹪)pGC-hTERT-2組(6.77±1.24﹪)而陰性對(duì)照組(8.07±0.166﹪)較48h升高，二者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 研究結(jié)論： (1)化學(xué)合成的siRNA-1和siRNA-2鏈能以一定的序列特異性高效抑制hTERTmRNA表達(dá)，抑制率分別為85﹪和45﹪。 (2)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體作用下質(zhì)粒載體能成功轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染率分別為5.74﹪、5.66﹪

9、、7.5﹪、4.31﹪。 (3)陽(yáng)性對(duì)照組(pGC-GAPDH)能明顯抑制GAPDHmRNA的表達(dá)，表明該質(zhì)粒載體介導(dǎo)RNAi的有效性，靶向hTERT的質(zhì)粒載體能夠明顯下調(diào)K562細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)，并表現(xiàn)出一定的序列特異性。 (4)該質(zhì)粒載體介導(dǎo)的RNAi能夠抑制K562細(xì)胞端粒酶活性，抑制時(shí)間能達(dá)到一周甚至更長(zhǎng)。 (5)48h時(shí)各質(zhì)粒載體作用組較陰性對(duì)照組能明顯增加細(xì)胞凋亡率，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋