乳腺癌血清microRNA表達譜差異分析及其功能驗證.pdf

1、目的：
　　以臨床確診的乳腺癌患者和正常體檢人員為對象，研究兩者血清中miRNAs的表達譜差異，通過篩選驗證，獲得乳腺癌血清特異性目的miRNAs，加快血清miRNA作為biomarker向臨床轉(zhuǎn)化的應用進程，為乳腺癌的診斷治療提供了新的潛在生物學標志物，同時對miRNA在乳腺癌中的功能進行初步研究，為miRNA乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用機制研究奠定基礎。
　　方法：
　　選取10例確診的乳腺癌病人和10例正常人樣本，利用高

2、通量測序?qū)?0對乳腺癌病理組織、旁組織、血清和正常人血清進行miRNA測序，并利用TargetScan、Clip-seq等數(shù)據(jù)庫篩選出在乳腺癌中特異表達的miRNAs;利用實時熒光定量RT-PCR對篩選結(jié)果進行大樣本血清驗證，利用SPSS統(tǒng)計分析，篩選出差異性表達的目的miRNAs，設計合成miRNA抑制劑，轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞MB-435、MB-468，利用CCK8檢測乳腺癌細胞株轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor后的活力，利用Targe

3、tScan、miRanda預測具有功能表達的miRNA靶基因，為功能研究奠定基礎。
　　結(jié)果：
　　1.分析乳腺癌病理組織、旁組織和正常人血清的miRNA高通量測序測序結(jié)果，通過對不同樣本的Clean data的比較，分析其共有Reads以及特有的Reads，以log2(FoldChange)＞=1、P-value＜0.01為差異表達的篩選標準，在986條差異表達中篩選出28個差異性表達的miRNAs，包括hsa-miR-1

4、44-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-323-5p、hsa-miR-110a-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-326-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-195a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-374-5p、hsa-miR-26a、hsa-mi

5、R-23-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-143、hsa-miR-30a、hsa-miR-126、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-99a、hsa-miR-451a、hsa-miR-320a、hsa-miR-223-3p。
　　2.以差異表達量大于2倍以上，RT-PCR中CT值小于30作為標準，共篩選出4條特異目的miRNAs，即hsa-miR-374a-5p、

6、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a進行血清學表達驗證分析。
　　3.在113例乳腺癌患者以及104例健康對照組血清中對目標miRNAs表達進行定量分析，結(jié)果表明miRNAs在血清中穩(wěn)定表達，乳腺癌組與對照組相比，hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p及hsa-miR-320a相對表達量上調(diào)，乳腺癌患者血清中4個目標miRNAs的表

7、達情況與前期乳腺癌組織中的表達情況一致，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，目的miRNAs的表達與臨床病理特征存在一定相關性。
　　4.我們選取測序結(jié)果中和驗證的目的miRNAs，利用CCK8檢測轉(zhuǎn)染后的細胞活力情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p inhibitor在MDA-MB-468中抑制miR-223-3p的表達，從而抑制MDA-MB-468的活力;同時，miR-423-5p inhibitor在MDA-MB-468和M

8、DA-MB-453中同時抑制這兩種細胞活力表達，提示miR-223-3p、miR-423-5p對乳腺癌細胞活性存在調(diào)控作用，具有抑制抑癌基因的功能;另利用TargetScan、miRanda兩個數(shù)據(jù)庫對miR-223-3p、miR-423-5p的靶基因進行預測，為下一步乳腺癌特異miRNA的功能研究奠定基礎。
　　結(jié)論：
　　本課題選取乳腺癌組織、癌旁組織以及乳腺癌血清和正常人血清為研究對象，利用新一代高通量測序篩選出差異表

9、達的miRNAs，初步建立了乳腺癌特異性的miRNAs差異表達譜。在對測序結(jié)果中表達上調(diào)的miR-374a-5p、miR-223-3p、miR-423-5p、miR-320a血清學驗證發(fā)現(xiàn)，其在血清和組織中的表達趨勢一致，并與臨床病理存在著關聯(lián)，有可能作為乳腺癌診斷的潛在標志物;在利用CCK-8檢測4個上調(diào)的miRNAs的功能中發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p、miR-423-5p在乳腺癌細胞中具有功能表達，可能發(fā)揮著抑制抑癌基因的作用，影響