FRNK對體內(nèi)外心肌肥大的抑制作用.pdf

1、研究背景和目的 臨床研究表明，心肌肥大是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥，是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)。初期的心肌肥大有一定的代償意義，但持續(xù)性心肌肥大，最終可導(dǎo)致心力衰竭，甚至猝死。因此，積極探明心肌肥大的發(fā)生機制，必將有利于減少心血管事件的發(fā)生。 粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是一個多功能非受體型酪氨酸激酶，是細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞

2、紐，其磷酸化可促進心肌肥大的發(fā)生發(fā)展。粘著斑相關(guān)非激酶(FAKrelatednon-kinase，F(xiàn)RNK)是FAK基因剪接產(chǎn)生的不具催化活性的C末端序列，其分子中缺乏FAK的N末端和激酶結(jié)構(gòu)域。FRNK與FAK一樣，都具有粘著斑定位序列(focaladhesiontargetingsequence，F(xiàn)AT)，因此可與FAK競爭結(jié)合粘著斑，進而特異性阻斷FAK的磷酸化。那么，作為FAK的一種抑制性同源蛋白，F(xiàn)RNK是否可以通過影響參與心

3、肌肥大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，從而減輕甚至逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大呢?它對體內(nèi)壓力超負荷所致病理性心肌肥大的治療作用又如何呢?帶著這些疑問，本文從血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的體外乳鼠心肌細胞肥大模型和腹主動脈狹窄所致體內(nèi)心肌肥大大鼠模型兩個層面研究了FRNK基因治療對心肌肥大的影響。 方法 首先根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫報道的FRNKcDNA序列，設(shè)計一對特異性引物，并分別在上下游引物的5'端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)逆

4、轉(zhuǎn)錄得到FRNKcDNA全長序列。利用BamHⅠ/EcoRⅠ酶切位點連接至真核表達載體pcDNA3.1上，構(gòu)建pcDNA3.1-FRNK重組質(zhì)粒，并進行限制性酶切分析和測序鑒定。 然后原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)建立體外心肌肥大模型，并用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-FRNK重組質(zhì)?；騪cDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細胞。測定心肌細胞表面積和蛋白質(zhì)含量。半定量RT-PCR法檢測心肌肥大特征性基因心鈉肽(ANP)mRNA的表達

5、。Westernblot法檢測心肌細胞FRNK、磷酸化FAK、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)信號分子的蛋白表達。 最后將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠制備腹主動脈狹窄模型，隨機分成：FRNK組(n=10)、pcDNA3.1組(n=9)及單純手術(shù)組(n=8)。其中FRNK組和pcDNA3.1組在術(shù)后1周，按4.0mg/kg體重劑量經(jīng)尾靜脈分別注射重組質(zhì)粒(pc

6、DNA3.1-FRNK)或空質(zhì)粒(pcDNA3.1)，3周后按相同劑量重復(fù)注射。假手術(shù)組(n=9)僅游離腹主動脈但不結(jié)扎。術(shù)后7周，通過左心導(dǎo)管測定各項血流動力學參數(shù)評價心功能；測定大鼠心臟重量/體重和左室重量/體重；心肌組織苦味酸天狼猩紅染色評價心肌間質(zhì)膠原沉積情況；RT-PCR檢測心肌肥大特征性基因心鈉肽(ANP)mRNA的表達。Westernblot分析導(dǎo)入基因后各組大鼠心肌組織中FRNK及磷酸化FAK的蛋白表達。 結(jié)果

7、 成功克隆FRNK功能片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FRNK，限制性核酸內(nèi)切酶酶切初步鑒定正確后，經(jīng)序列測定進一步證實所得片段序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫報道完全一致。 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-FRNK轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，可明顯下調(diào)經(jīng)AngⅡ觸發(fā)的心肌細胞表面積和ANPmRNA表達水平的增高(P＜0.05)，心肌細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FRNK后，高表達外源性FRNK基因，并可顯著抑制由AngⅡ引起的FA

8、K磷酸化。FRNK干預(yù)后的心肌細胞與肥大心肌細胞相比，p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達量下降，而總AKT、ERK1/2蛋白表達無顯著性差異。 將pcDNA3.1-FRNK經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入大鼠心肌肥大模型后，可引起血流動力學參數(shù)LVEDP下降，LVPSP及±dp/dtmax上升。FRNK組大鼠心臟重量/體重、左心室重量/體重明顯下降，心肌細胞結(jié)構(gòu)基本正常，心肌間質(zhì)膠原沉積不明顯，心肌組織ANPmRNA水平亦顯著下降。經(jīng)pcDNA3

9、.1-FRNK干預(yù)后的大鼠心肌組織高表達FRNK蛋白，而FAKTyr397磷酸化水平下調(diào)。 結(jié)論 本研究證實： ①pcDNA3.1-FRNK可抑制體外血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大反應(yīng)；該抑制作用與FRNK下調(diào)FAK磷酸化水平，繼而影響下游信號分子ERK1/2、AKT的活化相關(guān)； ②將攜帶FRNK基因的真核表達載體經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入至腹主動脈狹窄所致的大鼠心肌肥大模型體內(nèi)，可在心肌組織有效高表達，并顯著抑制心肌

10、肥大引起的FAK磷酸化。 ⑨FRNK還可顯著抑制心肌肥大時，間質(zhì)和血管周圍膠原沉積，并改善心肌肥大大鼠的心功能。這一研究結(jié)果為心肌肥大的治療開創(chuàng)了全新的思路。 研究背景和目的 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近來研究表明FAK是乳腺癌惡性表型的標志物，其持續(xù)激活與腫瘤細胞增殖密切相關(guān)。以往實驗研究已證實細胞發(fā)生異常增殖的重要機制之一是細胞周期調(diào)控功能的失常。FAK作為胞漿內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其關(guān)鍵性活化位點——T

11、yr397發(fā)生自身磷酸化后能顯著促進細胞周期的行進。一旦FAK活化受抑，則導(dǎo)致細胞周期阻滯，從而影響腫瘤細胞惡性增殖。FRNK是FAK基因單獨表達其C末端結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的同源蛋白，它和FAK一樣，都具有粘著斑定位序列(focaladhesiontargetingsequence，F(xiàn)AT)，可與FAK競爭粘著斑結(jié)合位點，但FRNK缺乏FAK的激酶活化區(qū)，遂不能引起FAK介導(dǎo)的下游信號分子活化，因此是FAK良好的內(nèi)源性抑制劑。但目前有關(guān)FRNK

12、如何干擾細胞周期，抑制乳腺癌細胞增殖的具體機制尚不清楚?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，本研究以課題1中成功克隆的FRNK基因作為研究對象，觀察其對人乳腺癌細胞系MDA-MB-435細胞周期的影響，探討FRNK抑制乳腺癌細胞增殖的可能機制。 方法 經(jīng)脂質(zhì)體分別介導(dǎo)攜帶目的基因FRNK的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-FRNK)、陽性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1-GFP)和空質(zhì)粒(pcDNA3.1)轉(zhuǎn)染MDA-MB-435細胞，以正常MDA-

13、MB-435細胞作為空白對照。通過檢測轉(zhuǎn)染后細胞FRNK蛋白的表達，并結(jié)合轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP后細胞表達熒光的多寡來評估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48h，利用Westernblot檢測各轉(zhuǎn)染組細胞FAK活化關(guān)鍵性位點Tyr397的自身磷酸化水平。采用MTT法分析轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h和72h各時間點細胞增殖情況。流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對MDA-MB-435細胞周期的影響，并檢測各組細胞核內(nèi)NF-κBp65的表達。 結(jié)

14、果 pcDNA3.1-FRNK質(zhì)?？山?jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染MDA-MB-435細胞，促進細胞FRNK的表達，F(xiàn)RNK表達量在轉(zhuǎn)染后48h達高峰。高表達FRNK的乳腺癌細胞的FAKTyr397位點磷酸化受到顯著抑制。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FRNK后，MDA-MB-435細胞增殖趨緩，且這種抑制增殖呈一定的時間依賴性；S+G2/M期的細胞比例較正常細胞顯著下降(P＜0.05=；MDA-MB-435細胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白表達減少。