二氫楊梅素通過Nrf2抑制NLRP3炎性體調(diào)控的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)已經(jīng)成為威脅人類健康的主要死亡病因之一，因此，尋找有效的AS防治措施是降低CVDs發(fā)病率和死亡率的重要策略。AS的發(fā)生與固有免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其起始于內(nèi)皮損傷，而炎癥反應(yīng)貫穿于AS各個(gè)階段;并且近年來研究報(bào)道細(xì)胞焦亡(pyroptosis)作為固有免疫的重要部分，參與了AS的進(jìn)程并影響斑塊的穩(wěn)定性，因此，減輕血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞炎性死亡（細(xì)胞焦亡）成為AS的防治重點(diǎn)。另一方面，NLRP3(NOD-like receptor protein3)炎性體作為固有免疫的受體或感受器，他的活化將激活半胱天冬酶-1（caspase-1）依賴的細(xì)胞焦亡，從而起始AS的發(fā)生發(fā)展。另外，研究證實(shí)線粒體功能紊亂及線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)是NLRP3炎性體活化的關(guān)鍵。因此，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞mtR

3、OS產(chǎn)生可改善NLRP3炎性體調(diào)控的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，從而防治AS的發(fā)生發(fā)展。
　　天然黃酮類化合物二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)在藤茶、烏墨、枳棋子等藥食兩用植物中含量豐富，具有抗氧化、抗炎、保肝等多種生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)DHM能顯著改善內(nèi)皮氧化損傷，但其作用機(jī)制與靶點(diǎn)尚未明確。并且，DHM能否通過Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，未見相關(guān)報(bào)道。因此，深入研究

4、DHM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的改善作用及其分子機(jī)制對(duì)于AS的防治具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也將為AS的藥物研發(fā)提供新的理論依據(jù)。
　　本研究利用原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對(duì)象，運(yùn)用siRNA轉(zhuǎn)染、熒光顯微鏡觀察、ELISA、免疫印跡、流式細(xì)胞分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了棕櫚酸(palmitic acid，PA)對(duì)HUVECs細(xì)胞焦亡的作用，并進(jìn)

5、一步研究了NLRP3炎性體及mtROS在PA誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞焦亡中的作用。另一方面，研究了DHM對(duì)PA誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞焦亡的影響，并深入探討了Nrf2相關(guān)信號(hào)通路在DHM調(diào)節(jié)NLRP3炎性體活化及細(xì)胞焦亡中的作用及機(jī)制。
　　全文主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1.PA可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)，PA明顯導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷（降低細(xì)胞活力和促進(jìn)LDH釋放），破壞細(xì)胞胞膜完整性，并促進(jìn)caspase-1活化體(C

6、asp1p20)、IL-1β、ICAM-1的表達(dá)，以及促炎癥因子IL-1β的成熟及分泌。而采用caspase-1抑制劑處理之后，PA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)損傷作用被抑制。結(jié)果表明，PA能夠誘導(dǎo)caspase-1依賴的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。
　　2.NLRP3炎性體活化是PA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡所必需的。PA能以劑量依賴的方式增加NLRP3蛋白的表達(dá)。NLRP3被siRNA或特異性抑制劑(MCC950)抑制后，PA誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的作用被顯著削

7、弱。結(jié)果表明，PA通過活化NLRP3炎性體誘導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。
　　3.PA通過誘導(dǎo)過量mtROS導(dǎo)致NLRP3炎性體活化進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞焦亡。PA能夠顯著增加血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS及mtROS的產(chǎn)生。而使用mtROS清除劑(Mito-TEMPO或NAC)處理之后，PA誘導(dǎo)的NLRP3炎性體及細(xì)胞焦亡作用被顯著抑制。結(jié)果表明，mtROS在PA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性體活化及細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用。
　　4.DHM能明顯改善

8、PA誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。主要表現(xiàn)在DHM能明顯改善血管內(nèi)皮細(xì)胞活力及細(xì)胞膜完整性，降低LDH、IL-1β釋放，并抑制NLRP3、Casp1p20、IL-1β、ICAM-1蛋白表達(dá)。
　　5.DHM通過調(diào)控Nrf2信號(hào)通路改善PA誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。DHM能劑量依賴地促進(jìn)Nrf2及HO-1、NQO1的表達(dá)，并顯著降低血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS及mtROS的水平。采用siRNA技術(shù)沉默Nrf2基因表達(dá)后，DHM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的改善