Nrf2對LPS誘導的肝細胞及肝星狀細胞NLRP3表達的影響.pdf

1、背景：
　　非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）已成為現(xiàn)今全球最常見慢性肝病之一，其發(fā)病機制尚未完全闡明[1,2]。近年研究顯示[3]，炎癥小體NLRP3與多種炎癥相關性疾病的發(fā)生密切相關，敲除NLRP3可以阻止高脂飲食導致的IR、肥胖和NAFLD的進展， NAFLD作為一種炎癥相關性疾病，NLRP3在其發(fā)病中的作用及機制的研究也日益受到重視[3]。
　　研究表明[4,5]，腸道菌群和高脂飲食共同作用產生以脂多糖（LPS）為主要

2、成分的代謝性內毒素血癥是NAFLD重要的致病因素。LPS作為Toll樣受體4（Toll-like4）的配體，能活化炎癥小體NLRP3，產生半胱氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1），介導促炎性細胞因子IL-1β和IL-18等的前體轉化為活性形式并分泌到細胞外，參與肝臟炎癥及胰島素抵抗（IR）的發(fā)生[6,7]。
　　氧化應激是炎性反應的一個重要特征，通常認為ROS可作為一個重要的上游信號調節(jié)炎癥小體NLRP3的活化[8,9]。轉錄

3、因子NF-E2相關因子2（Nrf2）是維持細胞內氧化平衡的關鍵轉錄因子，是調節(jié)細胞內氧化應激的中心環(huán)節(jié)[10]。既往大多數(shù)體內外研究及我們前期研究均表明[11-13]，Nrf2通過參與抗氧化還原反應而拮抗ROS，降低細胞內ROS水平。因此，我們推測Nrf2核轉位應該有助于降低NLRP3活化程度，對NAFLD起保護作用。然而，現(xiàn)有部分體外研究[14]卻得出了相反結果，其研究表明Nrf2是NLRP3活化的前提，敲除Nrf2導致庫普弗細胞（K

4、C）成熟障礙， NLRP3不能活化，這種矛盾的結果需要更深入的研究。因此，有必要對肝臟中除KC外的更多細胞進行研究，觀察Nrf2對其NLRP3表達的影響。
　　本研究以大鼠肝細胞和肝星狀細胞（HSC）為研究對象，觀察LPS誘導時NLRP3及其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18表達的變化。并使用姜黃素處理肝細胞和肝星狀細胞后，觀察Nrf2核轉位對NLRP3及其下游分子的影響。通過本研究明確Nrf2在LPS誘導

5、的肝細胞和肝星狀細胞損傷模型中對NLRP3及其下游分子的調控作用，為闡明NAFLD的發(fā)病機制提供實驗和理論依據(jù)。
　　目的：
　　本研究以大鼠肝細胞和肝星狀細胞為研究對象，利用LPS誘導NLRP3活化，觀察其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18表達的變化，以探討在肝細胞和肝星狀細胞中LPS對NLRP3表達的影響。在此基礎上誘導Nrf2核轉位，觀察其對炎癥小體NLRP3及下游相關分子的作用，以明確Nrf2

6、對NLRP3表達的影響，為闡明NAFLD的發(fā)病機制提供實驗和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用LPS構建大鼠肝細胞及肝星狀細胞損傷模型。按LPS誘導濃度不同將大鼠肝細胞及肝星狀細胞分別為0μg/mL(對照組)、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL共5個組，檢測不同濃度LPS誘導后細胞的活性及ALT、LDH、MDA及GSH的變化。
　　2.將大鼠肝細胞及肝星狀細胞分為對照組和實驗組(

7、按LPS誘導時間分為30min、60min、120min、240min組)，提取各組總mRNA，檢測各組細胞中NLRP3、Caspase-1及下游炎癥因子IL-1β及IL-18 mRNA水平的變化。
　　3.將大鼠肝細胞及肝星狀細胞分為對照組、LPS誘導組和姜黃素組。對照組未做處理；LPS組加入終濃度為0.2μg/mL的LPS，誘導時間為120min；姜黃素組在LPS誘導前8h加入濃度為25μmol/L的姜黃素，余操作和LPS誘導

8、組相同。Western Blot法檢測各組中胞核內Nrf2蛋白表達的變化，Real time PCR法檢測NLRP3及Caspase-1的mRNA表達量，ELISA法檢測各組中IL-1β及IL-18水平變化。
　　結果：
　　1.與0μg/mL組、0.05μg/mL組、0.1μg/mL組和0.2μg/mL組相比，0.4μg/mL組肝細胞活性顯著降低（P<0.05）；余各組間均無顯著差異（P＞0.05）?？梢姡琇PS誘導濃度達

9、0.4μg/mL時，與其余各組相比，肝細胞活性降至最低。與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝星狀細胞活性顯著升高（P<0.05）；與0.2μg/mL組相比，0.4μg/mL組肝星狀細胞活性顯著降低（P<0.05）。與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝細胞及肝星狀細胞 ALT、LDH、MDA水平顯著升高（P<0.05）；與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝細胞及肝星狀細胞 GSH水平顯著降低（P<0.05）。

10、
　　2.與60min組相比，120min組肝細胞及肝星狀細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達量顯著升高（P<0.05）；與120min組相比，240min組肝細胞及肝星狀細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達量降低?？梢姡琇PS誘導時間在30min到120min時，肝細胞及肝星狀細胞各組炎癥小體NLRP3、Caspase-1及其下游炎癥因子IL-1β及IL

11、-18 mRNA表達量隨LPS誘導時間延長而逐漸升高，在誘導時間為120min時達到峰值，隨后各mRNA表達量下降。
　　3.Western Blot檢測肝細胞及肝星狀細胞胞核中Nrf2蛋白的表達，與對照組相比，姜黃素組胞核Nrf2蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與LPS誘導組相比，姜黃素組中胞核Nrf2蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。Real time PCR檢測肝細胞及肝星狀細胞NLRP3及Caspase-1mRNA的表達

12、，與對照組相比， LPS誘導組中NLRP3及Caspase-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS誘導組相比，姜黃素組中NLRP3及Caspase-1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）。ELISA檢測肝細胞及肝星狀細胞IL-1β及IL-18水平，與LPS誘導組相比，姜黃素組中IL-1β及IL-18水平顯著降低（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.通過不同濃度的LPS誘導，成功構建肝細胞及肝星狀細胞的損傷

13、模型。
　　2.LPS能誘導NLRP3激活，并促進其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18mRNA的表達，并且在LPS作用120min時達到峰值，隨后表達下降。
　　3.Nrf2核轉位能顯著降低NLRP3及其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18的表達，表明Nrf2的核轉位能抑制NLRP3的活化，進而對NAFLD發(fā)揮保護作用。本結果與Nrf2在巨噬細胞中對NLRP3的調節(jié)作用相反，提示