Nrf2對LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞NLRP3表達(dá)的影響.pdf

1、背景：
　　非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）已成為現(xiàn)今全球最常見慢性肝病之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1,2]。近年研究顯示[3]，炎癥小體NLRP3與多種炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，敲除NLRP3可以阻止高脂飲食導(dǎo)致的IR、肥胖和NAFLD的進(jìn)展， NAFLD作為一種炎癥相關(guān)性疾病，NLRP3在其發(fā)病中的作用及機(jī)制的研究也日益受到重視[3]。
　　研究表明[4,5]，腸道菌群和高脂飲食共同作用產(chǎn)生以脂多糖（LPS）為主要

2、成分的代謝性內(nèi)毒素血癥是NAFLD重要的致病因素。LPS作為Toll樣受體4（Toll-like4）的配體，能活化炎癥小體NLRP3，產(chǎn)生半胱氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1），介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18等的前體轉(zhuǎn)化為活性形式并分泌到細(xì)胞外，參與肝臟炎癥及胰島素抵抗（IR）的發(fā)生[6,7]。
　　氧化應(yīng)激是炎性反應(yīng)的一個重要特征，通常認(rèn)為ROS可作為一個重要的上游信號調(diào)節(jié)炎癥小體NLRP3的活化[8,9]。轉(zhuǎn)錄

3、因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）是維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的中心環(huán)節(jié)[10]。既往大多數(shù)體內(nèi)外研究及我們前期研究均表明[11-13]，Nrf2通過參與抗氧化還原反應(yīng)而拮抗ROS，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。因此，我們推測Nrf2核轉(zhuǎn)位應(yīng)該有助于降低NLRP3活化程度，對NAFLD起保護(hù)作用。然而，現(xiàn)有部分體外研究[14]卻得出了相反結(jié)果，其研究表明Nrf2是NLRP3活化的前提，敲除Nrf2導(dǎo)致庫普弗細(xì)胞（K

4、C）成熟障礙， NLRP3不能活化，這種矛盾的結(jié)果需要更深入的研究。因此，有必要對肝臟中除KC外的更多細(xì)胞進(jìn)行研究，觀察Nrf2對其NLRP3表達(dá)的影響。
　　本研究以大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC）為研究對象，觀察LPS誘導(dǎo)時NLRP3及其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)的變化。并使用姜黃素處理肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞后，觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位對NLRP3及其下游分子的影響。通過本研究明確Nrf2在LPS誘導(dǎo)

5、的肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞損傷模型中對NLRP3及其下游分子的調(diào)控作用，為闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供實驗和理論依據(jù)。
　　目的：
　　本研究以大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞為研究對象，利用LPS誘導(dǎo)NLRP3活化，觀察其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)的變化，以探討在肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中LPS對NLRP3表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，觀察其對炎癥小體NLRP3及下游相關(guān)分子的作用，以明確Nrf2

6、對NLRP3表達(dá)的影響，為闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供實驗和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用LPS構(gòu)建大鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞損傷模型。按LPS誘導(dǎo)濃度不同將大鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞分別為0μg/mL(對照組)、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL共5個組，檢測不同濃度LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞的活性及ALT、LDH、MDA及GSH的變化。
　　2.將大鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞分為對照組和實驗組(

7、按LPS誘導(dǎo)時間分為30min、60min、120min、240min組)，提取各組總mRNA，檢測各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1及下游炎癥因子IL-1β及IL-18 mRNA水平的變化。
　　3.將大鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞分為對照組、LPS誘導(dǎo)組和姜黃素組。對照組未做處理；LPS組加入終濃度為0.2μg/mL的LPS，誘導(dǎo)時間為120min；姜黃素組在LPS誘導(dǎo)前8h加入濃度為25μmol/L的姜黃素，余操作和LPS誘導(dǎo)

8、組相同。Western Blot法檢測各組中胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)的變化，Real time PCR法檢測NLRP3及Caspase-1的mRNA表達(dá)量，ELISA法檢測各組中IL-1β及IL-18水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.與0μg/mL組、0.05μg/mL組、0.1μg/mL組和0.2μg/mL組相比，0.4μg/mL組肝細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）；余各組間均無顯著差異（P＞0.05）?？梢?，LPS誘導(dǎo)濃度達(dá)

9、0.4μg/mL時，與其余各組相比，肝細(xì)胞活性降至最低。與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝星狀細(xì)胞活性顯著升高（P<0.05）；與0.2μg/mL組相比，0.4μg/mL組肝星狀細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）。與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞 ALT、LDH、MDA水平顯著升高（P<0.05）；與0.1μg/mL組相比，0.2μg/mL組肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞 GSH水平顯著降低（P<0.05）。

10、
　　2.與60min組相比，120min組肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與120min組相比，240min組肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18 mRNA表達(dá)量降低。可見，LPS誘導(dǎo)時間在30min到120min時，肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞各組炎癥小體NLRP3、Caspase-1及其下游炎癥因子IL-1β及IL

11、-18 mRNA表達(dá)量隨LPS誘導(dǎo)時間延長而逐漸升高，在誘導(dǎo)時間為120min時達(dá)到峰值，隨后各mRNA表達(dá)量下降。
　　3.Western Blot檢測肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞胞核中Nrf2蛋白的表達(dá)，與對照組相比，姜黃素組胞核Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，姜黃素組中胞核Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。Real time PCR檢測肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞NLRP3及Caspase-1mRNA的表達(dá)

12、，與對照組相比， LPS誘導(dǎo)組中NLRP3及Caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，姜黃素組中NLRP3及Caspase-1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。ELISA檢測肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞IL-1β及IL-18水平，與LPS誘導(dǎo)組相比，姜黃素組中IL-1β及IL-18水平顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過不同濃度的LPS誘導(dǎo)，成功構(gòu)建肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的損傷

13、模型。
　　2.LPS能誘導(dǎo)NLRP3激活，并促進(jìn)其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18mRNA的表達(dá)，并且在LPS作用120min時達(dá)到峰值，隨后表達(dá)下降。
　　3.Nrf2核轉(zhuǎn)位能顯著降低NLRP3及其下游分子Caspase-1及炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，表明Nrf2的核轉(zhuǎn)位能抑制NLRP3的活化，進(jìn)而對NAFLD發(fā)揮保護(hù)作用。本結(jié)果與Nrf2在巨噬細(xì)胞中對NLRP3的調(diào)節(jié)作用相反，提示