新型mTOR抑制劑Y31延緩大鼠多囊腎病進(jìn)展的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　隨著醫(yī)療檢測(cè)水平和人們健康知識(shí)水平的不斷提高，常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)，已經(jīng)逐漸被人們所熟知。這種最常見(jiàn)的單基因遺傳性腎病，其發(fā)病率之高，并發(fā)癥之重，給患者家庭和整個(gè)社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ADPKD的發(fā)病率約為1/400-1/1000，其病理特點(diǎn)是雙腎滿(mǎn)布大小不等、充滿(mǎn)囊液的液性囊泡，隨著病程的進(jìn)展、囊液的不斷分泌和蓄積，囊泡不斷增大，同時(shí)壓迫臨近的正常腎組織，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的不可逆損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，

2、ADPKD患者在60歲以后，約有一半以上的患者會(huì)進(jìn)展到終末期腎病(ESRD)。ADPKD目前尚無(wú)有效的治療方法，病人進(jìn)入ESRD后，主要的治療措施為透析治療包括血液透析，腹膜透析和腎臟移植治療。
　　目前認(rèn)為ADPKD的致病基因主要包括兩個(gè)即多囊腎病基因1(PKD1)和多囊腎病基因2(PKD2)。PKD1和PKD2編碼的蛋白分別為多囊蛋白1(PC1)和多囊蛋白2(PC2)，PC1和PC2在胞內(nèi)側(cè)通過(guò)C末端相互作用構(gòu)成復(fù)合體，起到陽(yáng)

3、離子通道作用，通過(guò)感受機(jī)械壓力等各種刺激，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣離子的內(nèi)流，傳遞細(xì)胞信號(hào)。但是近幾年在臨床發(fā)現(xiàn)部分有ADPKD臨床表現(xiàn)的患者，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)以上兩個(gè)基因位點(diǎn)的突變，提示我們可能存在pdk1和pkd2之外的致病基因。
　　因此本研究采用了新型mTOR抑制劑Y31來(lái)研究其對(duì)Han:SPRD多囊腎病大鼠的治療作用及可能作用機(jī)制。Y31由長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科與中國(guó)科學(xué)院藥物研究所共同研發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn)其藥代動(dòng)力學(xué)與水溶性等特性要明顯優(yōu)于Ra

4、pamycin，有可能成為新的治療ADPKD的有效藥物。
　　mTOR抑制劑對(duì)于mTOR的抑制作用已經(jīng)明確，而mTOR對(duì)于JAK-STAT1/3的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)有越來(lái)越多的研究，而本科室前期的研究表明，JAK-STAT1/3對(duì)于補(bǔ)體B因子(CFB)有正向調(diào)控作用，而CFB通過(guò)活化巨噬細(xì)胞等作用促進(jìn)多囊腎病的發(fā)生發(fā)展也已經(jīng)被證實(shí)，因此我們考慮mTOR抑制劑可能會(huì)通過(guò)JAK-STAT1/3這一途徑影響補(bǔ)體B因子的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)多囊腎病的

5、疾病進(jìn)程，所以在本研究還會(huì)觀察mTOR抑制劑對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的影響。
　　傳統(tǒng)mTOR抑制劑在臨床試驗(yàn)中未能取得令人滿(mǎn)意的效果，考慮其原因一方面為，相比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用藥，患者口服藥物劑量較小，另一方面的原因可能為mTOR被抑制后，其負(fù)反饋通路PI3K-AKT通路被激活，最終導(dǎo)致mTOR抑制不完全，治療效果不理想，此外傳統(tǒng)Rapamycin水溶性差導(dǎo)致腎臟局部藥物濃度偏低也可能是重要原因之一。因此本研究擬通過(guò)聯(lián)合用藥，多靶點(diǎn)治療，實(shí)現(xiàn)對(duì)多囊

6、腎病大鼠的有效治療。
　　二甲雙胍(Metformin)，是目前治療2型糖尿病的一線降糖藥物，它是目前公認(rèn)的AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMPK)激動(dòng)劑，AMPK活化后，可以通過(guò)直接或間接方式抑制mTOR，此外它還可以通過(guò)激活具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸梅活性的雙重特異性磷酸酶PTEN來(lái)抑制PI3K-AKT通路的激活，進(jìn)而抑制mTOR的活化。因此本研究擬通過(guò)新型mTOR抑制劑Y31與Metformin的聯(lián)合用藥來(lái)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)治療。由于Me

7、tformin自身有mTOR抑制作用，因此聯(lián)合用藥可以減少mTOR抑制劑的使用劑量，進(jìn)而可以減少mTOR抑制劑所帶來(lái)的感染等并發(fā)癥，同時(shí)Metformin具有激活PTEN進(jìn)而抑制PI3K-AKT通路的作用，可以降低甚至阻斷抑制mTOR后所導(dǎo)致的負(fù)反饋通路激活。這樣聯(lián)合用藥治療多囊腎病的模式在ADPKD研究中尚屬首次，旨在通過(guò)本研究，為臨床治療ADPKD探索新的治療物藥及治療模式。
　　方法：
　　采用多囊腎病動(dòng)物模型Han:

8、 SPRD多囊腎病大鼠和人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12細(xì)胞系，通過(guò)灌胃等給藥方式給藥，內(nèi)眥及心臟取血等方法取血檢測(cè)腎功能指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)藥物的治療作用;使用western bloting，組織病理切片染色，MTT等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)藥物對(duì)大鼠腎臟組織以及wT9-12細(xì)胞中mTOR通路相關(guān)蛋白p-p70s6k及mTOR負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白分子p-AKT表達(dá)量的變化，檢測(cè)補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體B因子(CFB)及補(bǔ)體C3降解片段表達(dá)量的變化，

9、觀察藥物對(duì)大鼠腎臟囊腫生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖的影響等以探討藥物的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　在第一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與多囊腎病對(duì)照組(Ctrl)相比，陽(yáng)性對(duì)照藥物RAPA(1mg/kg)以及治療藥物Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以顯著降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重體重比、囊腫指數(shù)指標(biāo)以及血肌酐和尿素氮，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)發(fā)現(xiàn)給予Y312mg/kg組體重下降比較明顯，與Ctrl組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　在第二部分動(dòng)

10、物實(shí)驗(yàn)中，與多囊腎病對(duì)照組(Ctrl)相比，陽(yáng)性對(duì)照藥物RAPA(0.5mg/kg和1mg/kg)以及治療藥物Metformin(150mg/kg)和Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重體重比以及血肌酐和尿素氮，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)發(fā)現(xiàn)給予Y312mg/kg組體重下降比較明顯，與Ctrl組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與多囊腎病對(duì)照組(Ctrl)相比，聯(lián)合用藥組均可以降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的雙腎重

11、體重比以及血肌酐和尿素氮，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)發(fā)現(xiàn)MET150mg/kg聯(lián)合Y312mg/kg組體重下降比較明顯，與Ctrl組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但是聯(lián)合用藥未出現(xiàn)藥物的協(xié)同或者疊加效應(yīng)，在腎功能血肌酐及尿素氮的保護(hù)方面，聯(lián)合用藥組明顯優(yōu)于相應(yīng)的MET單藥，且肌酐和尿素氮的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是與相應(yīng)的mTOR抑制劑組相比肌酐和尿素氮的下降沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　在第三部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與多囊腎病對(duì)照組(Ctrl)相比，Metformin（250m

12、g/kg）單藥治療，Metformin與RAPA聯(lián)合用藥治療以及RAPA（0.5mg/kg）單藥治療均可顯著降低Han: SPRD多囊腎病大鼠的血肌酐和尿素氮，聯(lián)合用藥組的治療效果要明顯優(yōu)于Metformin單藥，但是與RAPA單藥治療組相比，相應(yīng)腎功能的改善并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　Western blotting結(jié)果顯示，Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)同RAPA（1mg/kg）一樣，可以顯著降低Han: SPRD多囊腎

13、病大鼠腎臟組織中mTOR通路下游蛋白p-p70s6k的表達(dá)量;而Y31(0.5mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以一定程度的增加Han: SPRD多囊腎病大鼠腎臟組織中mTOR負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中相關(guān)蛋白p-AKT的表達(dá)量，但是Y31(2mg/kg)卻能顯著降低p-AKT的表達(dá)量。
　　Western blotting方法結(jié)果顯示，Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以顯著降低Han:SPRD多囊

14、腎病大鼠腎臟組織中補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體B因子(CFB)以及補(bǔ)體C3降解片段C3b和C3c的表達(dá)量。
　　免疫組化檢測(cè)顯示Y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及RAPA(1mg/kg)可以顯著降低Han:SPRD多囊腎病大鼠腎臟組織切片中增殖細(xì)胞核抗原Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。
　　MTT法檢測(cè)提示，在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的Y31后，可以抑制WT9-12細(xì)胞的細(xì)胞增殖率，且在一定范圍內(nèi)呈

15、線性關(guān)系。
　　Western blotting方法結(jié)果顯示，在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的Y31作用后，可顯著減少WT9-12細(xì)胞中mTOR通路下游蛋白p-P70s6k蛋白的表達(dá)量，并且高濃度的Y31(50uM)能顯著降低WT9-12細(xì)胞p-AKT的表達(dá)量。
　　Western blotting方法結(jié)果顯示，在人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12細(xì)胞中給予不同藥物濃度的Y31刺激后，可以顯著減少WT

16、9-12細(xì)胞中補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)蛋白補(bǔ)體B因子(CFB)及補(bǔ)體C3降解片段C3c的表達(dá)量。
　　結(jié)論：
　　本研究首先在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了新型mTOR抑制劑Y31同傳統(tǒng)的mTOR抑制劑具有同樣的抑制mTOR信號(hào)通路的作用，并且大劑量的Y31具有抑制mTOR負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白p-AKT表達(dá)的作用。首次提出了mTOR抑制劑對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制從而緩解多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展的新作用。然而本研究發(fā)現(xiàn)，Metformin單藥雖然具有延

17、緩多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展的作用，但是與mTOR抑制劑聯(lián)合用藥后未出現(xiàn)聯(lián)合使用藥物的協(xié)同或者疊加作用。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，亦證明了新型mTOR抑制劑Y31對(duì)于mTOR信號(hào)通路的抑制作用，高濃度的Y31同樣顯示了對(duì)于p-AKT表達(dá)的抑制作用，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也再次驗(yàn)證了其對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制作用。因此，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了新型mTOR抑制劑Y31可以通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路及補(bǔ)體系統(tǒng)、大劑量的Y31尚可抑制mTOR負(fù)反饋通路中關(guān)鍵蛋白p-A