18β--甘草次酸在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第三位、致死率居世界第四位。在中國，隨著生活水平的提升和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐漸提高。盡管目前的診斷和治療有許多新進(jìn)展，其轉(zhuǎn)移率和死亡率仍然居高不下。
　　目前結(jié)直腸癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等。手術(shù)治療仍是主要的治療方案，但是有多數(shù)的患者在手術(shù)前發(fā)現(xiàn)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不適合手術(shù)治療。對于不能

2、手術(shù)的患者，化療顯得尤為重要?；熡兄谧柚辜?xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞死亡，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。但是化療藥物昂貴且有較多的副作用如骨髓抑制、疼痛等使得部分病人難以忍受，且目前越來越多的病人出現(xiàn)了化療多藥耐藥性。所以尋找新型抗腫瘤藥物成為了目前研究的重點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥是比較好的候選資源，多種藥物已被證明具有較弱的毒副作用和較強(qiáng)的化療效果。
　　甘草是中藥中最廣泛使用的成分之一，已被用于多種疾病的治療。18β-甘草次酸（18β-Gly

3、cyrrhetinic Acid，GRA）是其主要成分之一。已有文獻(xiàn)報道GRA具有抗微生物、抗炎、抗病毒和肝保護(hù)等作用。GRA的抗腫瘤作用也有相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)GRA可以抑制乳腺癌、胃癌、卵巢癌的增殖、轉(zhuǎn)移等，其機(jī)制包括抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡等。且GRA對腫瘤細(xì)胞具有選擇性毒性，即GRA對正常細(xì)胞沒有損傷效應(yīng)。目前對于GRA在結(jié)直腸癌中的研究未有報道。
　　目的：
　　觀察GRA對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

4、，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用CCK-8法檢測GRA對結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、SW480和SW620的增殖抑制作用。
　　2.構(gòu)建結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型，腹腔注射GRA，通過定期測量腫瘤體積和小鼠體重，觀察GRA在體內(nèi)對結(jié)腸腫瘤增殖的影響。
　　3.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測GRA對結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡作用;RT-qPCR檢測GRA對凋亡抑制蛋白survivin表達(dá)的影響

5、;Western blotting檢測GRA對多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)表達(dá)的影響。
　　4.利用Transwell小室檢測GRA刺激結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、SW480和SW620后細(xì)胞的侵襲和遷移情況;劃痕實(shí)驗(yàn)觀察GRA對LoVo細(xì)胞遷移作用。
　　5.Western blotting檢測GRA刺激LoVo、SW480和SW620細(xì)胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)-1、2、3、9的表達(dá)情況以及相關(guān)信號通路:PI3K/A

6、KT、STAT3、MAPK和NF-κB蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.GRA體外可抑制腸癌細(xì)胞LoVo、SW480和SW620的增殖，呈劑量依賴性，而對正常腸上皮細(xì)胞NCM460沒有明顯的抑制作用。半數(shù)抑制濃度(IC50)在NCM460、LoVo、SW480和SW620細(xì)胞，24小時分別為866、99.48、153.8、360.9μM，48小時分別為144.8、71.23、88.23、88.28μM，72小時分別為14

7、1.3、43.23、34.64、60.19μM。
　　2.腹腔注射GRA可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，減少腫瘤體積，減緩荷瘤小鼠體重的下降，并且延長生存期。
　　3.GRA促進(jìn)腸癌細(xì)胞LoVo、SW480和SW620的凋亡，下調(diào)凋亡抑制基因survivin的表達(dá)，促進(jìn)PARP的剪切。
　　4.Transwell小室侵襲遷移實(shí)驗(yàn)表明，GRA作用細(xì)胞后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、SW480和SW620的穿膜數(shù)量明顯減少，與對照組之間有顯

8、著性差異(p<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GRA明顯抑制LoVo的遷移能力。
　　5.Western blotting發(fā)現(xiàn)不同濃度的GRA處理細(xì)胞后，MMP-1、2、3、9表達(dá)明顯下降，呈濃度依賴，且PI3K/AKT、STAT3、p38、JNK和NF-κB磷酸化水平明顯下降，而ERK的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變。GRA刺激不同的時間后，Westernblotting結(jié)果表明PI3K和STAT3磷酸化水平最早開始下降，約于GRA刺激后2