池塘放射孢子蟲種類調(diào)查及熒光定量PCR檢測(cè)方法.pdf

1、粘孢子蟲是后生動(dòng)物寄生蟲，除少數(shù)寄生于蠕蟲、兩棲類、爬行類外，其余廣泛寄生于魚類當(dāng)中，其生長(zhǎng)發(fā)育需要兩個(gè)替換宿主，包括放射孢子蟲階段的水棲寡毛類的中間宿主和成熟孢子階段的魚類宿主。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，江蘇是我國(guó)鯽魚養(yǎng)殖的主要地區(qū)之一。然而，自90年代起，江蘇地區(qū)的鯽魚養(yǎng)殖就一直遭受到粘孢子蟲病害的困擾，給鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重影響了江蘇鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究對(duì)江蘇地區(qū)池塘放射孢子蟲的種類進(jìn)行了初步調(diào)查和分類鑒定，并建立起

2、對(duì)洪湖碘泡蟲的一種熒光定量PCR快速檢測(cè)方法和洪湖碘泡蟲體外感染實(shí)驗(yàn)，旨在為粘孢子蟲的分類和生活史研究提供一些理論基礎(chǔ)，并為鯽魚粘孢子蟲病防治提供一定的理論依據(jù)。
　　1.蘇氏尾鰓蚓寄生的放射孢子蟲的調(diào)查與分類2013年5月到2013年9月期間，作者從江蘇省常州市，鹽城大豐市，揚(yáng)州江都市等地暴發(fā)過粘孢子蟲病的鯽魚養(yǎng)殖塘采回的水蚯蚓帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀察，一共觀察到五種類型放射孢子蟲，即古放射孢子蟲(Guyenotia type)，三突

3、放射孢子蟲(Triactinomyxon type)，雷放射孢子蟲(Raabeia type)，桔瓣放射孢子蟲(Aurantiactinomyxon type)和新放射孢子蟲(Neoactinomyxum type)。通過形態(tài)學(xué)和18S rDNA序列比對(duì)以及構(gòu)建發(fā)育樹的綜合比較之后，推測(cè)Guyenotia type可能為可能為一種楚克拉蟲(Zschokkella sp.)在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對(duì)應(yīng)的放射孢子蟲，Raabeia type可

4、能為可能為一種碘泡蟲(Myxobolus sp.)在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對(duì)應(yīng)的放射孢子蟲，Aurantiactinomyxon type和Neoactinomyxum type可能分別為一種單極蟲(Thelohanellus sp.)在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對(duì)應(yīng)的放射孢子蟲。
　　2.洪湖碘泡蟲熒光定量PCR快速鑒定本研究以粘孢子蟲通用引物EMIB1&10擴(kuò)增洪湖碘泡蟲（Myxobolus honghuensis）、塔形碘泡蟲（My

5、xoboluspyramidis）、瓶囊碘泡蟲(Myxobolus bottliformis)、吳李碘泡蟲(Myxobolus wulii)、卡特碘泡蟲(Myxobolus cultus)、武漢單極蟲（Thelohanellus wuhanensis），楚克拉蟲（Zschokkella sp.）瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其可用性。針對(duì)洪湖碘泡蟲的快速檢驗(yàn)，利用熒光定量PCR方法，設(shè)計(jì)特異性引物HF-F&R，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有洪湖碘泡蟲組生成“S”

6、形的熒光曲線，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證只有洪湖碘泡蟲組有80bp左右條帶，說明設(shè)計(jì)的特引物具有很好的特異性;另外熒光定量PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示可以檢測(cè)出洪湖碘泡蟲裂解液10-4稀釋樣品，取洪湖碘泡蟲孢囊10-4稀釋液2μL在顯微鏡下觀察，僅觀察到3個(gè)洪湖碘泡蟲，說明利用特異性引物hf-F&R進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)出具有3個(gè)左右及以上洪湖碘泡蟲樣品。
　　3.洪湖碘泡蟲人工感染蘇氏尾鰓蚓實(shí)驗(yàn)本文以洪湖碘泡蟲人工感染蘇氏尾鰓蚓，經(jīng)