幾種重要外源因子對草魚肝細(xì)胞活力、抗氧化、凋亡和熱應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idellus）又稱白鯇、草根魚、厚魚，有生長快速、產(chǎn)量高和養(yǎng)殖成本低的特點(diǎn)，是中國重要的淡水養(yǎng)殖品種。2011年中國草魚總產(chǎn)量達(dá)到454萬噸，居世界首位(FAO，2012)，具有極好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。草魚已經(jīng)被東亞，北美和歐洲超過100個(gè)國家引進(jìn)。目前在中國和世界其他地區(qū)，草魚在養(yǎng)殖過程中面臨病害頻發(fā)和藥物濫用問題，特別是高溫下，魚類病害進(jìn)一步加劇。這不利于草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本論文針對養(yǎng)殖過程

2、中的高溫脅迫因子，以草魚肝細(xì)胞為研究對象，開展不同溫度應(yīng)激及其恢復(fù)對草魚肝臟細(xì)胞氧化損傷和熱應(yīng)激蛋白表這影響研究，探索大黃素和恩諾沙星對草魚肝臟細(xì)胞毒性、氧化損傷、凋亡和熱應(yīng)激蛋白（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。分析了高溫預(yù)處理和低濃度大黃素對草魚肝細(xì)胞抗高溫應(yīng)激的保護(hù)作用，為探討大黃素的應(yīng)激調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。
　　1.不同高溫應(yīng)激和恢復(fù)對草魚肝細(xì)胞活力、氧化損傷和熱應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響本試驗(yàn)是為了研究不同高溫應(yīng)激

3、和恢復(fù)對草魚肝細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)釋放、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)產(chǎn)物、總抗氧化能力(T-AOC)、熱應(yīng)激蛋白（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。首先將培養(yǎng)的草魚肝細(xì)胞分別在高溫30℃、32℃和34℃條件下暴露0.5 h，然后將各組細(xì)胞立即放回27℃恢復(fù)6h、12h、24 h和48h。結(jié)果表明高溫顯著降低細(xì)胞活力，增加了LDH釋放?；謴?fù)后細(xì)胞損傷減少。高溫應(yīng)激增加了MDA水平，降低了抗氧化能力

4、（降低了細(xì)胞的SOD活性和T-AOC）。然而，氧化損傷隨著恢復(fù)時(shí)間增加而下降，MDA、SOD活性和T-AOC有所恢復(fù)。當(dāng)細(xì)胞暴露于32℃，HSP60 mRNA的表達(dá)在恢復(fù)6h和24 h高于對照組(P＜0.05)，HSP70mRNA的表達(dá)在恢復(fù)6h、24 h和48 h高于對照組(P＜0.05)，HSP90mRNA的表達(dá)在恢復(fù)6h和24 h高于對照組（P＜0.05）。恢復(fù)過程中，HSPs基因表達(dá)的變化反映了細(xì)胞從生長狀態(tài)過渡到細(xì)胞修復(fù)狀態(tài)。

5、總之，高溫抑制細(xì)胞活力，引起氧化損傷，并增加HSPs表達(dá)，而HSPs在草魚肝細(xì)胞的熱應(yīng)激中有重要作用。
　　2.高溫應(yīng)激不同時(shí)間對草魚肝細(xì)胞活力、氧化損傷和熱應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)的研究目的是探討高溫應(yīng)激不同時(shí)間對草魚肝細(xì)胞活力、LDH釋放、SOD活性、MDA產(chǎn)物、T-AOC和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。把培養(yǎng)的細(xì)胞在高溫(32℃)下分別暴露0.5、1、2、4、8 h。結(jié)果表明，高溫應(yīng)激

6、顯著降低細(xì)胞活力(P＜0.01)，增加0.5 h和1h處理組的LDH釋放(P＜0.05)。此外，0.5和8h高溫處理組的T-AOC明顯降低(P＜0.05)，1h高溫處理組的SOD活性明顯降低(P＜0.05)，8h處理組MDA產(chǎn)物顯著增加(P＜0.05)，表明高溫引起氧化應(yīng)激。這可能一定程度解釋了此時(shí)細(xì)胞活力的減少和LDH釋放的增加。SOD活性、MDA產(chǎn)物和T-AOC在高溫應(yīng)激2h和對照組之間的差距最小。這表明，細(xì)胞能誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)對抗

7、氧化應(yīng)激。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，HSP60 mRNA在應(yīng)激1、2和4h(P＜0.05)，HSP70 mRNA在應(yīng)激0.5和1h（P＜0.01），和HSP90mRNA在所有應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)都顯著增加（P＜0.01）。這表明HSPs有能力調(diào)節(jié)細(xì)胞抗應(yīng)激反應(yīng)，對保護(hù)生物熱應(yīng)激有重要作用?？傊?，高溫抑制草魚肝細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，提高HSPs表達(dá)。
　　3.大黃素和恩諾沙星對草魚肝細(xì)胞活力、抗氧化能力、凋亡和熱應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

8、
　　本試驗(yàn)是為了探討不同濃度大黃素和恩諾沙星對草魚肝細(xì)胞活力、LDH釋放、SOD活性、谷胱甘肽(GSH)、T-AOC、MDA產(chǎn)物、活性氧(ROS)、細(xì)胞膜電位（ΔΨm）、凋亡和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。把培養(yǎng)的細(xì)胞用不同濃度大黃素(0.04-25μg·mL-1)和恩諾沙星(12.5-200μg·mL-1)處理24 h。結(jié)果表明，大黃素（1-25μg·mL-1）增加LDH釋放(P＜0.05)，其誘導(dǎo)

9、的細(xì)胞凋亡伴隨著ΔΨm的下降和ROS的升高;大黃素處理組SOD活性和T-AOC顯著降低表明大黃素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致失去其清除自由基的酶的活性，而GSH的升高表明細(xì)胞嘗試去維持氧化還原平衡，但是不足以補(bǔ)償大黃素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。同時(shí)大黃素誘導(dǎo)HSP60、70和90 mRNA表達(dá)上升，說明大黃素可以產(chǎn)生保護(hù)作用。而用恩諾沙星處理細(xì)胞表明，恩諾沙星(50-200μg·mL-1)也顯著降低細(xì)胞活力增加LDH釋放(P＜0.05)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和膜電位

10、下降(P＜0.05)，恩諾沙星顯著升高ROS和MDA產(chǎn)物，降低T-AOC（P＜0.05）表明恩諾沙星引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，破壞氧化平衡。HSP60和HSP70mRNA在低濃度的恩諾沙星作用下先升高，后下降，而HSP90mRNA的表達(dá)持續(xù)下降說明高濃度恩諾沙星導(dǎo)致細(xì)胞的病理性損傷或蛋白合成受到抑制。
　　4.不同高溫預(yù)處理對大黃素處理草魚肝細(xì)胞的影響
　　本試驗(yàn)是為了研究不同高溫預(yù)處理對大黃素處理的草魚肝細(xì)胞活力、LDH釋放、S

11、OD活性、T-AOC、ROS、ΔΨm和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。把培養(yǎng)的細(xì)胞在高溫30℃、32℃和34℃暴露0.5 h，然后立即放回27℃恢復(fù)12 h，接著把細(xì)胞用不同濃度大黃素（0.04-25μg·mL-1）處理24 h。試驗(yàn)結(jié)果顯示，30℃預(yù)處理組顯著增加高濃度大黃素組(1、5、25μg· mL-1)細(xì)胞活力（P＜0.05），降低LDH釋放(P＜0.05)，提高細(xì)胞膜電位（P＜0.05），說明30℃高

12、溫預(yù)處理可以減輕大黃素對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷;30℃高溫預(yù)處理組的ROS最低，和大黃素對照組之間差異顯著（P＜0.05），這表明草魚肝細(xì)胞在大黃素處理后，機(jī)體正在經(jīng)歷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，細(xì)胞有可能引起生理功能紊亂甚至喪失;30℃高溫預(yù)處理組SOD活性和T-AOC顯著增加(P＜0.05)，說明30℃溫和高溫預(yù)處理使細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化酶而保護(hù)其不受ROS的損傷;3種高溫預(yù)處理（30℃、32℃和34℃）都能顯著增加HSPs的表達(dá)(P＜0.05)，由此推

13、斷出高溫預(yù)處理使得草魚肝細(xì)胞預(yù)先誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSPs會(huì)保護(hù)氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡，對高濃度大黃素產(chǎn)生的細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　5.不同濃度大黃素對高溫應(yīng)激草魚肝細(xì)胞的影響
　　本試驗(yàn)是為了研究不同濃度大黃素對高溫應(yīng)激草魚肝細(xì)胞活力、LDH釋放、SOD活性、T-AOC、ROS、ΔΨm和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達(dá)的影響。把培養(yǎng)的細(xì)胞用不同濃度大黃素處理（0.04-1μg·mL-1）處理24 h，然后讓細(xì)

14、胞在高溫32℃應(yīng)激0.5 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.04μg·mL-1大黃素濃度組細(xì)胞活力顯著高于高溫應(yīng)激組(P＜0.05)，LDH釋放顯著低于高溫應(yīng)激組(P＜0.05)，說明0.04μg·mL-1大黃素對高溫應(yīng)激細(xì)胞有保護(hù)作用。而其他大黃素處理組和高溫應(yīng)激組差異不顯著，說明大黃素的保護(hù)作用并沒有劑量效應(yīng)，0.04μg·mL1大黃素濃度組SOD活性高于高溫應(yīng)激組(P＜0.05)，ROS含量低于高溫應(yīng)激組，說明大黃素可有效地提高細(xì)胞SOD抗氧化酶的