PPARγ基因沉默對細胞炎癥反應的調控作用.pdf

1、炎癥，作為與人類多種疾患息息相關的病理過程而備受國際醫(yī)學界的矚目，目前仍是臨床與基礎醫(yī)學研究的重要課題。業(yè)已研究證實，過度炎癥反應是創(chuàng)傷后多種并發(fā)癥，如膿毒癥/膿毒性休克、急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能不全綜合征等的重要病理基礎。為此，我們已從效應細胞表面膜受體、細胞內信號通路、靶基因表達調控、效應細胞凋亡與炎癥反應的關系四方面研究炎癥反應的發(fā)生機制和關鍵的調控環(huán)節(jié)，并在此基礎上尋找新的抗炎措施。近五年來，我們不僅在揭示創(chuàng)傷后炎癥反應發(fā)

2、生機制方面取得一定的進展，同時，研究發(fā)現，機體自身的抗炎保護效應機制也是影響炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。此外，我們研究發(fā)現，嚴重創(chuàng)傷早期，體內單核細胞合成促炎介質能力明顯增強，但隨后卻明顯受抑，細胞產生抗炎介質如IL-1Ra、IL-10無明顯減少?；谏鲜鼋Y果，我們認為，炎癥應是一個促炎與抗炎反應相互依存、互為拮抗的復雜過程，伴隨炎癥產生的各種內源性抗炎保護效應機制固然是機體在炎癥環(huán)境下得以維持內環(huán)境穩(wěn)定的根本需要，但抗炎機制的失調，不僅是

3、促使早期有限性保護性炎癥反應轉化為破壞性過度炎癥反應的重要機制，同時也是造成創(chuàng)傷機體免疫力低下、對感染易感性增加的重要原因。然而，對于機體自身調控抗炎反應的機制，迄今尚鮮見文獻報道。 近年研究發(fā)現，細胞內過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARs)通過反式阻抑機制對細胞的促炎反應具有明顯的抑制作用。PPARs有三種異構體：PPARα、PPARβ/δ和

4、PPARγ，在巨噬細胞、樹突細胞、T細胞、B細胞等廣泛表達。早期研究認為，它們在調節(jié)脂質代謝方面發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現，PPARs也是調控炎癥反應的關鍵點(checkpoint)。有關PPARγ抗炎作用研究發(fā)現：PPARγ激動劑能明顯抑制炎性刺激誘導單核/巨噬細胞產生促炎細胞因子(TNFα、IL1、IL6、NO)的產生；PPARγ配體預處理野生型動物，能明顯降低組織內促炎細胞因子的表達，減輕炎癥局部和遠隔部位的組織損傷，對多種實驗性

5、炎性疾病，如急性心肌炎、自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化等均顯示較好的治療作用；然而，PPARγ基因敲除可導致胚胎死亡，目前尚無PPARγ缺陷動物，僅有通過同源重組建立的PPARγ+/-嵌合小鼠模型。關于PPARγ對細胞其它抗炎保護效應的調控作用，迄今文獻報道甚少。鑒于PPARγ在抗炎反應方面的獨特作用機制，即通過反式結合，作用于多種核轉錄因子或/和胞漿輔蛋白。我們認為炎癥發(fā)生過程中PPARγ不僅調控促炎介質的合成，也可能影響抗炎介質產生

6、，是維持細胞促炎與抗炎反應動態(tài)平衡的重要調節(jié)點。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是Fire等在線蟲中首次發(fā)現的，隨后在果蠅、昆蟲、植物、哺乳動物體內均發(fā)現這種現象。所謂RNAi是指雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在體內被切割為21-25nt(nucleotide)的小片段，這種小的雙鏈RNA可特異性識別其互補mRNA，促使其降解，使相關基因處于轉錄后基因沉默(post-tra

7、nscriptionalgenesilencing，PTGS)，從而使細胞表現出特定基因缺失的表型。RNAi與基因敲除或同源重組技術相比，其操作簡單、成本低廉，與反義技術相比，對基因表達的抑制更特異、更有效。因此，采用RNAi技術研究候選基因的功能以及基因治療實驗已成為當今生命科學研究的熱點。 鑒于PPARγ對多種重要轉錄因子的反式作用特點，本研究在明確PPARγ自身表達變化規(guī)律的基礎上，利用RNAi表達載體構建技術，構建插入P

8、PARγ目的序列的pSUPER-EGFP重組質粒；通過轉染沉默效應最佳的重組質粒，觀察PPARγsiRNA對RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的干預作用，并在此基礎上，深入研究PPARγ對炎癥反應，特別是細胞抗炎保護效應的信號轉導機制，旨在深入闡明PPARγ在維持細胞促炎與抗炎反應動態(tài)平衡中的重要作用，以期進一步揭示細胞自身對抗炎反應的調控機制，并為深化炎癥的相關研究提供新思路。 主要結果如下：1.LPS呈時間依賴性地刺激RAW2

9、64.7巨噬細胞PPARγ蛋白表達，且以PPARγ胞漿蛋白增加為主，細胞核PPARγ蛋白表達水平變化不明顯，僅在LPS刺激16h有一過性下調(P＜0.01)。在觀察時間內，PPARγ胞漿與胞核蛋白比值呈不斷增加趨勢，LPS刺激5h后，比值高于對照組(P＜0.05)，這表明LPS刺激后不僅胞漿PPARγ蛋白表達增加，而且影響其在胞核與胞漿的再分布。 2.姜黃素能夠顯著增加RAW264.7細胞胞漿內PPARγ蛋白表達，且PPARγ胞

10、核蛋白亦呈上調趨勢，PPARγ胞漿與胞核蛋白比值隨刺激時間延長比值不斷增加。提示，姜黃素不僅能夠上調PPARγ蛋白表達，而且能夠促進胞漿PPARγ蛋白遷移到胞核。 3.在姜黃素預刺激后，LPS刺激能夠增加RAW264.7細胞PPARγ蛋白在胞漿、胞核內的含量，且胞核PPARγ蛋白表達在LPS刺激12、16、24h高于同時間點LPS組胞核PPARγ蛋白表達水平(P＜0.05，P＜0.01)，PPARγ蛋白的胞漿與胞核比值在LPS刺

11、激3h后，顯著高于對照組(P＜0.01)，隨觀察時間后移呈上調趨勢。這表明，姜黃素能夠逆轉LPS對PPARγ蛋白由胞漿向胞核遷移的抑制作用。 4.在RNA干擾重組質粒構建中，通過優(yōu)化靶序列篩選及構建條件，成功構建了四種PPARγ-pSUPER-EGFP，四種質粒對PPARγ基因在轉錄和翻譯水平均有不同程度的抑制作用，且以重組質粒2對PPARγ基因的沉默效應最顯著(P＜0.01)。 5.LPS刺激后，RAW264.7細胞p

12、42/44MAPK磷酸化水平顯著增加，但在PPARγ基因沉默后，LPS刺激時p42/44MAPK磷酸化水平與沉默前比較無明顯變化(P＞0.05)。LPS刺激后IkappaB-alpha表達顯著減少(P＜0.01)，PPARγ基因沉默后，LPS刺激時IkappaB-alpha降解的速度和幅度均顯著高于沉默前LPS組(P＜0.01)。姜黃素預刺激能夠顯著抑制LPS刺激后RAW264.7巨噬細胞IkappaB-alpha的降解過程，PPARγ

13、基因沉默后，姜黃素在一定程度上，仍然能夠抑制LPS刺激后IkappaB-alpha降解。 6.LPS刺激后，RAW264.7細胞TNFα和IL-1Ra表達水平增加，但TNFα表達高峰時間較IL-1Ra靠前。姜黃素能夠顯著抑制LPS刺激后RAW264.7細胞TNFα表達。PPARγ基因沉默后，姜黃素對LPS刺激時RAW264.7細胞TNFα表達的抑制顯著減弱。不同劑量的羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細胞TNFα表達僅有一定

14、程度的抑制作用，PPARγ基因沉默后，羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細胞TNFα表達與PPARγ基因沉默前比較沒有差異(P＞0.05)。 7.姜黃素對LPS刺激后RAW264.7細胞IL-1Ra表達水平無顯著影響，PPARγ基因沉默后，姜黃素對LPS刺激后RAW264.7細胞IL-1Ra表達與PPARγ基因沉默前比較亦無差異(P＞0.05)。不同劑量的羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細胞IL-1Ra表達增加。PPA

15、Rγ基因沉默后，不同劑量羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細胞IL-1Ra表達仍然呈增加趨勢，在刺激8h，IL-1Ra表達顯著高于對照組，而與PPARγ基因沉默前相應對照組比較沒有差異(P＞0.05)。 結論：1.LPS刺激后，RAW264.7巨噬細胞PPARγ蛋白表達增加主要集中在細胞漿內，姜黃素不僅能夠上調PPARγ蛋白表達，促進PPARγ蛋白由胞漿遷移到胞核，還可以逆轉LPS對PPARγ蛋白由胞漿向胞核遷移的抑制作用，

16、有效調節(jié)PPARγ蛋白表達及其在胞漿/胞核的分布是調控RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的重要環(huán)節(jié)。 2.在RNA干擾重組質粒構建中，靶序列篩選及構建條件的優(yōu)化為以質粒介導的RNA干擾研究提供了參考，所建重組質粒不僅為PPARγ功能缺陷細胞系的建立提供了條件，也為PPARγ基因功能研究及相關疾病的基因治療提供了細胞模型。四種PPARγ-pSUPER-EGFP質粒對PPARγ基因在轉錄和翻譯水平均有不同程度的抑制作用，且以重組質粒2

17、對PPARγ基因的沉默效應最顯著。 3.LPS刺激后，RAW264.7巨噬細胞通過PPARγ介導的抗炎反應并不改變ERK細胞信號通路的激活狀態(tài)，而是通過減少IkappaB-alpha磷酸化和降解，抑制NF-κB的激活與核轉位。姜黃素介導的PPARγ依賴性的抗炎效應包括對NF-κB信號通路的拮抗作用，但PPARγ可能并不是其唯一的信號通路分子，其他下游信號通路分子可能通過非PPARγ依賴性途徑發(fā)揮抗炎效應，PPARγ僅是姜黃素發(fā)揮

18、抗炎效應的靶分子之一。 4.RAW264.7細胞促炎反應與抗炎反應可能具有序貫性的特點，姜黃素上調并激活PPARγ的表達與LPS刺激后TNFα表達呈負相關，而與IL-1Ra表達無關。PPARγ配體羅格列酮對RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的拮抗與IL-1Ra表達增加相關，且羅格列酮對LPS刺激后RAW264.7細胞IL-1Ra表達的干預呈PPARγ非依賴性。選擇姜黃素與PPARγ配體伍用的抗炎策略對于巨噬細胞過度炎癥反應的調控可